品
胆汁酸激活癌症相关成纤维细胞并在胆管癌中诱导免疫抑制微环境
图形摘要
突出
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胆汁酸-GPBAR1 轴重编程 CAFs 以在 CCA 中建立免疫抑制生态位
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CAF 衍生的 CXCL10 诱导中性粒细胞募集并维持其未成熟表型
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靶向 GPBAR1 或 CXCL10 可降低 CCA 免疫抑制并提高抗 PD-1 疗效
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GPBAR1-CXCL10 轴参数通过激活 CXCR3 的 CCA 细胞的 EMT
作者
黄帆， 刘增利， 宋燕， ...， 荆伟强， 张宗利， 徐云飞
通信
panchang0517@163.com （CP）、wjing1@sdu.edu.cn （WJ）、zzlzzl1900@163.com （Z.Z.）、xuyunfei1988@126.com （Y.X.）
简述
Huang 等人揭示了胆管癌肿瘤微环境中的高胆汁酸水平会激活癌症相关成纤维细胞上的 GPBAR1，诱导 CXCL10 分泌。这会募集中性粒细胞并维持其未成熟表型，从而增强免疫抑制。靶向 GPBAR1 或 CXCL10 可增强 pembrolizumab 反应，为提高胆管癌免疫治疗效果提供潜在策略。
Huang 等人，2025 年，《癌细胞》第 43 期，2025 © 年 8 月 11 日，1-16 页，2025 年，爱思唯尔公司。保留所有权利，包括文本和数据挖掘、AI 训练和类似技术的权利。https://doi.org/10.1016/j.ccell.2025.05.017
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胆汁酸激活癌症相关成纤维细胞并在胆管癌中诱导免疫抑制微环境
黄帆，刘增利，宋燕，王甘玉，石安达，陈天丽，黄绍辉，连硕，李康帅，唐永昌，郑丽杰，盛国丽，张诺琪，杨帆，潘畅，*荆伟强，*张宗利*和徐云飞*
1
山东大学齐鲁医院奇鲁医学院普外科， 山东 250012 济南
2
胆道肿瘤青岛市基础研究与个体化治疗重点实验室， 山东 青岛 266035
3 山东大学齐鲁医院青岛市奇鲁医学院普外科，山东 266035 青岛
4
山东大学齐鲁医院清鲁医学院泌尿外科， 济南， 250012
5 山东大学车鲁医学院基础医学院生物化学与分子生物学系，教育部实验畸形学重点实验室，山东 250012 济南
6
山东大学齐鲁医院急诊医学科， 山东省济南市 250012
7
这些作者的贡献相同
8 主要联系人 *通信方式：panchang0517@163.com （C.P.）、wjing1@sdu.edu.cn （W.J.）、zzlzzl1900@163.com （Z.Z.）、xuyunfei1988@126.com （Y.X.） https://doi.org/10.1016/j.ccell.2025.05.017
总结
胆管癌 （CCA） 是一种起源于胆道的高度致命的恶性肿瘤，其特征是暴露于高水平的胆汁酸 （BA）。免疫疗法在 CCA 中的疗效有限，但其潜在机制仍难以捉摸。在这项研究中，我们揭示了过量的 BAs 特异性激活癌症相关成纤维细胞 （CAF） 上的 GPBAR1 以表达高水平的 CXCL10，增强上皮-间充质转化 （EMT） 和 CCA 细胞的转移，并通过在 CCA 中募集中性粒细胞产生免疫抑制性肿瘤微环境 （TME）。有趣的是，单细胞 RNA 测序分析表明，CCA 中的 CAFs，而不是检查的其他癌症类型，特异性表达 BAs 受体 GPBAR1。GPBAR1-CXCL10 轴抑制增强了 pembrolizumab 在多个 CCA 临床前模型中的疗效。高 BA 水平和 GPBAR1 表达上调预示着预后不良和免疫治疗反应较差。综上所述，我们的研究揭示了 BAs 的免疫抑制机制，并确定 GPBAR1 和 CXCL10 是 CCA 中的潜在免疫治疗靶点。
介绍
胆管癌 （CCA） 包括一组起源于胆管的高度异质性恶性肿瘤。根据其解剖位置，CCA 分为肝内 CCA （iCCA）、肺门周围 CCA （pCCA） 和远端 CCA （dCCA），其中 pCCA 和 dCCA 也被视为肝外 CCA （eCCA）。每种亚型都有不同的流行病学、生物学、预后和临床管理。近几十年来，CCA 的全球发病率一直在不断上升。然而，预后仍然令人沮丧，5 年总生存率 （OS） 仅为 7%-20%。CCA 在早期通常无症状，由于局部晚期或转移期，大多数 CCA 患者 （65%–75%） 在诊断时不符合根治性手术的条件。对于这些患者，10 多年来，顺铂加吉西他滨一直是唯一的标准一线治疗，但其疗效仍然有限
客观缓解率 （ORR） 为 26%。免疫检查点抑制剂 （ICI），尤其是那些靶向程序性细胞死亡蛋白 1 （PD-1） 或其配体 PD-L1 的抑制剂，已经彻底改变了各种恶性肿瘤的癌症治疗，但迄今为止，没有抗 PD-1/PD-L1 单药疗法在提高 CCA 生存率方面显示出显着疗效。此外，与单独化疗相比，抗 PD-1/PD-L1 治疗联合一线化疗仅将中位 OS 改善了一个月。
癌症相关成纤维细胞 （CAF） 是活化成纤维细胞的一个亚群，表达不同的表型标志物，包括 α-平滑肌肌动蛋白 （α-SMA）、成纤维细胞活化蛋白 （FAP） 和波形蛋白。CAF 在肿瘤微环境 （TME） 中发挥着多种作用。CAFs 通过分泌生长因子、细胞因子和细胞外基质 （ECM） 成分影响肿瘤细胞的生长、侵袭、转移和血管生成;同时，CAFs 能够通过调节免疫细胞的活性和功能来调节免疫微环境，从而影响肿瘤免疫
癌细胞 43， 1–16， 2025 © 年 8 月 11 日 2025 爱思唯尔公司
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保留所有权利，包括文本和数据挖掘、AI 训练和类似技术的权利。
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请在媒体上引用这篇文章： Huang et al.， 胆汁酸激活癌症相关成纤维细胞并诱导胆管癌免疫抑制微环境， 癌细胞 （2025）， https://doi.org/10.1016/j.ccell.2025.05.017
宽容。 了解 CAFs、肿瘤细胞和免疫细胞之间的复杂相互作用对于解开肿瘤免疫逃逸机制和开发有效的免疫治疗策略至关重要，这在 CCA 中尤为重要，因为广泛的成纤维细胞和低血管基质是该疾病的特征性组织学特征。尽管 CAFs 被认为是决定肿瘤为免疫治疗“冷”还是“热”的关键因素，但与其他常见肿瘤相比，CAFs 在 CCA 中的作用尚未得到很好的研究。此外，目前的研究大多主要集中在 CAFs 与 CCA 中肿瘤细胞之间的相互作用，而 CAFs 与免疫细胞之间的相互作用研究相对不足。因此，在 CCA 微环境中全面描述 CAF 对于提高我们对 CCA 进展的了解和改进新的治疗方法至关重要。
与其他肿瘤相比，暴露于胆汁是 CCA 的一个显著特征，可形成高胆汁酸 （BAs） 的微环境。在胆管中，BA 的浓度可高达 300 mM，在肠道和结肠中降至 0.2-3 mM。在胆管狭窄的情况下，胆管中的 BA 水平可以广泛上调。据报道，BAs 可调节 T 细胞功能和肿瘤进展，但 BA 受体在这些过程中的作用以及 BAs 对 TME 中其他细胞的影响尚未得到彻底研究。尽管 CCA 的特征是暴露于高水平的 BAs，但 BA 在 CCA 进展和免疫治疗中的作用仍未得到探索。在我们的研究中，我们观察到高 BA 、 CCA 进展和免疫抑制之间存在正相关。我们通过在多个临床前动物模型和 CCA 队列中鉴定 CAFs 上的 GPBAR1 和 CAF 衍生的 CXCL10 作为响应 BA 诱导的免疫抑制的关键介质，进一步阐明了分子机制。此外，我们描述了由 BA-GPBAR1-CXCL10 轴控制的肿瘤细胞、中性粒细胞和 CAFs 之间的复杂相互作用。
结果
BA、BA 受体与 CCA 临床病理因素的相关性
胆汁淤积和 BA 升高是 CCA 的标志性特征，但 BA 在 CCA 进展中的作用尚不清楚。因此，我们首先调查了由 157 名患者组成的 CCA 队列中血清 BAs 与临床病理因素之间的相关性 （表 S1）。血清 BAs 升高与肿瘤大小和淋巴结转移显著相关，表明 BAs 在 CCA 进展中具有潜在作用（图 1A）。此外，对 CCA 组织中 CD8 和 PD-1 进行免疫荧光 （IF） 染色以评估耗竭的 CD8T 细胞，表明高 BA 水平与增加的 T 细胞耗竭之间存在正相关（图 1B 和 S1A）。
BAs 主要通过与 BA 受体结合发挥作用，包括核受体 （FXR、VDR、LXR 和 PXR） 和膜受体 （GPBAR1、S1PR2、毒蕈碱受体 CHRM2/ CHRM3 和组成型雄甾烷受体 CAR）。在 scRNAseq 结果中研究了所有这些受体的表达，该结果整合了我们自己的数据，包括 3 个 pCCA、4 个 dCCA 和 4 个肿瘤相邻胆管组织 （GSE213452），以及先前报道的 iCCA scRNA-seq 数据 （GSE138709）。
在这些受体中，GPBAR1 主要在 CCA 的 CAF 中表达，这一结论也得到了其他 iCCA scRNA 数据集（GSE189903 和 GSE125449）的支持（图 1C 和 S1B-S1F）。此外，使用 FACS，我们从人 CCA 和邻近组织以及小鼠原位 CCA 模型中分离出不同的细胞类型，随后分析了 GPBAR1 和其他 BA 受体的表达。在人和小鼠 CCA 中，GPBAR1 表达主要高于 CAF 中的其他 BA 受体（20-324 倍），也明显高于其他细胞类型中的 GPBAR1 表达（5.8-92.4 倍）（图 S1G 和 S1H）。此外，GPBAR1 在 CCA 的 CAFs 中的表达显著高于肿瘤邻近组织或其他胆汁淤积疾病（如原发性硬化性胆管炎）的成纤维细胞中的表达（图 S1I-S1J）。在包括 iCAF 、 myCAF 、 vCAF 和 apCAF 在内的经典 CAF 亚型中，GPBAR1 表达除了 apCAFs 略有下调外，没有显着变化 （图 S1K）。更有趣的是，乳腺癌、胃癌、结肠癌、胰腺导管腺癌和其他 5 种肿瘤类型的泛癌 scRNA-seq 分析显示，GPBAR1 在 CCA 的 CAF 中具有特异性的高表达（图 1D）。
与来自其他癌症类型、成纤维细胞 HFL1、正常胆管上皮 HIBEpiC、CCA 细胞系或从肿瘤邻近组织中分离的成纤维细胞的 CAF 相比，源自人或小鼠 CCA 组织的 CAF 具有显著更高的 GPBAR1 表达（图 1E 和 S1L-S1M）。在我们由 409 名 CCA 患者组成的 CCA 队列中，与肿瘤邻近组织相比，IF 和免疫组织化学 （IHC） 显示 CAF 中 GPBAR1 的表达上调（图 1F 和 S1N-S1O）。CAFs 中 GPBAR1 的高表达表明所有 CCA 亚型的预后不良 （图 S1P）。此外，GPBAR1 在 CAFs 中的表达与分化、大血管浸润、肿瘤大小、淋巴结转移和 TNM 分期相关 （表 S2 和 S3）。
BA 通过激活 CAF 的 GPBAR1 促进 CCA 进展和免疫抑制
为了研究 CAF 衍生的 GPBAR1 在 CCA 中的功能，我们采用了 S100a4;GPBAR1 小鼠（以下简称 GPBAR1-cKO）在成纤维细胞中进行 GPBAR1 条件敲除（cKO），并通过将小鼠 CCA 细胞系 LD1 局部注射到肝脏中，然后腹膜内施用 GPBAR1 特异性激动剂 INT777（图 1G 和 S2A-S2D）。与 Gpbar1 小鼠相比，GPBAR1-cKO 小鼠的中位生存时间显著延长 （43.5 天 vs. 37.5 天） 和肿瘤重量减轻。INT777 显着增强肝内转移和肿瘤大小，加强免疫抑制，缩短小鼠的生存时间，而 GPBAR1-cKO 消除了这种作用（图 1H 和 S2E）。此外，通过睡美人系统肝脏过表达 AKT 和 YAP 质粒，通过流体动力学尾静脉注射 （HTVi） 递送，采用内源性原位 CCA 模型来模拟 CCA 肿瘤发生。通过 HTVi 将带有 loxp-stop-loxp （LSL） 盒的 GPBAR1 编码质粒转染到 GPBAR1-cKO 小鼠中，仅在细胞中过表达 GPBAR1，Crecells 是肝脏中的成纤维细胞（图 1I 和 S2F-S2H）。采用胆总管结扎 （CBDL） 和高胆酸 （CA） 饮食产生升高的 BA，细胞角蛋白 7 和 19 通过 IHC 染色至
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癌细胞 43,1-16,2025 年 8 月 11 日
请在媒体上引用这篇文章： Huang et al.， 胆汁酸激活癌症相关成纤维细胞并诱导胆管癌免疫抑制微环境， 癌细胞 （2025）， https://doi.org/10.1016/j.ccell.2025.05.017
图 1.BA 通过激活 CAF 中的 GPBAR1 来促进 CCA
（A） Pearson（左）或 Spearman（右）分析中 CCA 患者血清 BA 水平、肿瘤直径和阳性淋巴结数量之间的相关性。（B） CCA 患者血清 BA 水平与耗竭 CD8T 细胞与总 CD8T 细胞比率之间的相关性。耗竭的 CD8T 细胞在免疫共荧光中被定义为 CD8APD-1 细胞。
（C） 在 CCA 的 scRNA-seq 数据中，GPBAR1 主要在其他细胞类型的 CAF 中表达。
（D） 泛癌 scRNA-seq 分析显示不同 BA 受体在 CCA （GSE213452， GSE138709）、黑色素瘤 （GSE189889）、膀胱癌 （GSE130001）、乳腺癌 （GSE263995）、结直肠癌 （GSE234804）、食管鳞状细胞癌 （GSE203115）、胃癌 （GSE183904）、肝细胞癌 （GSE282701）、肺腺癌 （GSE131907） 和胰腺导管腺癌 （GSE231535） 的 CAF 中的表达。
（E） GPBAR1 在 HuCCT1、HFL1 和源自 CCA、胃癌、乳腺癌和结直肠癌的原发性 CAFs 中的表达。（F） 检测并比较 CCA 和副肿瘤组织中 GPBAR1 和 FAP 的表达 （肿瘤 = 409，副肿瘤 = 120） （左），并用 Kaplan-Meier 方法绘制 CAFs 中 GPBAR1 与 OS 之间的相关性。（G） 采用原位 CCA 模型，将 LD1 细胞和/或 CAFs 肝内注射到 Gpbar1 或 GPBAR1-cKO 小鼠中，用 INT777 处理（每天 30 毫克/千克，腹腔注射）。肝脏 H&E 染色、生物发光成像中肿瘤的辐射效率、转移性结节的数量以及小鼠耗竭的 CD8T 细胞的比例 （n = 6）。
（H） 处理为 （G） 的小鼠的生存曲线 （n = 10）。
（I） Gpbar1 或 GPBAR1-cKO 小鼠内源性模型中成纤维细胞条件性 GPBAR1 过表达的示意图。用他莫昔芬治疗成纤维细胞中 GPBAR1-cKO 的小鼠，并通过 HTVi 方法注射 EF1α-LSL-Gpbar1 质粒，在 Cre 细胞中仅过表达 GPBAR1。AKT 和 YAP 质粒由 HTVi 递送用于内源性模型，并采用 CBDL 处理或高 CA 饮食 （1%） 来产生升高的 BA 水平。
（J） 小鼠肝脏 H&E 染色、肿瘤数量、H&E 染色中的肿瘤面积和耗竭 CD8T 细胞的比例 （n = 6）。
（K） 处理为 （I） 的小鼠的存活曲线 （n = 10）。
（L） 血清中的总 BA 水平和人 CCA 组织中的 TIF （n = 6）。
（M） 用靶向 MS 检测血清和 TIF 中 BA 水平的组成 （n = 20）。
（N） 通过 GloSensor cAMP 测定法检测主要 BAs 对 GPBAR1 的亲和力 （n = 6）。
n.s. 表示不显著。*、** 和 *** 表示表示组之间的 P < 0.05、0.01 和 0.001。使用未配对的 t 检验 （F 中间） 、配对 t 检验 （L） 或单因素方差分析与随后的 Tukey 事后检验 （G 右和 J 右） 分析数据。使用 Kaplan-Meier 曲线绘制 OS 曲线，并通过对数秩检验 （F right、H 和 K） 评估统计差异。数据表示为 ± SMART 的平均值。
另见图 S1 和 S2。
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请在媒体上引用这篇文章： Huang et al.， 胆汁酸激活癌症相关成纤维细胞并诱导胆管癌免疫抑制微环境， 癌细胞 （2025）， https://doi.org/10.1016/j.ccell.2025.05.017
图 2.GPBAR1 通过 Gαs-cAMP-SOX4 轴诱导 CXCL10 的表达和分泌来促进 CCA 转移 （A） CellPhoneDB 分析表明 CAFs 与 CCA 组织 scRNA-seq 数据中其他细胞类型的潜在相互作用。
（B） 将 CAFs 的 CCA 细胞与 GPBAR1-KD 或 INT777 预处理在 CM 中孵育，并通过 transwell 试验 （左） 和 WB （右） （n = 6） 检测侵袭和 EMT 水平。（C） 将 CCA 细胞 TFK-1 和/或 GPBAR1-KO CAFs （5：1） 注射到 NOD/SCID 小鼠中，并用 CBDL 或高 CA 饮食处理。显示了肝叶中的肿瘤 H&E 染色、生物发光成像中肿瘤的辐射效率和左图小鼠转移性结节的数量 （n = 6）。
（D） 处理为 （C） 的小鼠的生存曲线 （n = 10）。
（E） 在接受 INT-777 （30 μM） 处理或 GPBAR1-KD 的 CAFs 中，分别用 Olink 蛋白质组学和 mRNA-seq 检测分泌的 DEPs 和上调的 DEGs（左）。用 INT777 （30 μM） 刺激、敲低 GPBAR1 或敲除 CAF 中的 CXCL10 后，用 qPCR、WB 和 ELISA 评估 iCCA/eCCA 衍生的 CAFs（中）或培养基（右）中 CXCL10 的表达 （n = 6）。
（F） CCA 细胞与 INT777 处理的 CM 或 GPBAR1-KD/CXCL10-KO CAFs 一起孵育，有或没有 CXCL10 中和抗体 （5 μg/mL），然后检测迁移、侵袭和 EMT （n = 6）。（G） 通过交叉 INT777 刺激后上调的 DEGs、敲低 GPBAR1 后下调的 DEGs 和潜在的 TFs 来筛选负责 CXCL10 转录的潜在 TFs。（H） 左图：INT777 （30 μM） 刺激后原代 iCCA 和 eCCA CAFs 中 SOX4、FOSB 和 HES1 的 mRNA 表达。右图：荧光素酶报告基因测定用于检测 CXCL10 在 SOX4 或 HES1 沉默的 CAF 中的转录活性 （n = 6）。
（图例在下一页继续）
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请在媒体上引用这篇文章： Huang et al.， 胆汁酸激活癌症相关成纤维细胞并诱导胆管癌免疫抑制微环境， 癌细胞 （2025）， https://doi.org/10.1016/j.ccell.2025.05.017
病理确认 CCA（图 S2I）。有趣的是，接受 CBDL 治疗和 CA 饮食的小鼠肿瘤数量更多，肿瘤大小增大，CD8 T 细胞耗竭百分比更高，生存时间缩短，所有这些都被 GPBAR1-cKO 缓解。值得注意的是，编码 GPBAR1 的质粒恢复了 GPBAR1-cKO 小鼠的肿瘤进展和免疫抑制，并缩短了存活时间（图 1I-1K 和 S2J-S2L）。这些结果表明，BA 通过激活 GPBAR1 促进 CCA 的肿瘤发生和进展。
BAs 是 GPBAR1 的天然配体，因此，我们使用 BA 检测试剂盒测量了 CCA 患者和小鼠模型的血清和肿瘤间质液 （TIF） 中的 BA 水平。与相应的血清水平相比，CCA TIF 中的 BA 水平在人类中高 3.2 倍，在小鼠中高 8.8 倍（图 1L 和 S2M）。TME 中 BA 的这种显着升高可能导致 GPBAR1 的过度激活。此外，我们用靶向质谱检测了人和小鼠的瘤内 BA 和血清 BA 的概况。在人类中，与血清相比，TME 中的 TIF 显着增加 TCDCA 并降低 CDCA（图 1M）。我们之前的研究报道，BAs 能够通过偶联 Gαs 和 Gαq 来激活 GPBAR1，并且 GPBAR1 通过 Gα s.In GloSensor cAMP 测定检测到的主要 BAs 促进肿瘤进展，TCDCA 对 GPBAR1 的亲和力第二高 （EC50 = 0.25μM），而 CDCA 是 GPBAR1 亲和力最低的 BAs 之一 （EC50 = 8.3μM） （图 1N 和 S2N）。在小鼠中，TIF 中 TCA 和 βMCA 的百分比增加，两者对小鼠 GPBAR1 的亲和力都优于其他 BA（图 S2O）。上述结果表明 CAF 衍生的 GPBAR1 在 CCA 的微环境中过度激活。
GPBAR1 在 CAFs 上的激活直接增强 CCA 侵袭和 EMT
一般来说，CAFs 通过分泌各种生物激活剂来调节其他细胞的活性并重塑 TME。我们的 scRNA-seq 的 CellPhoneDB 分析表明，CAFs 与肿瘤细胞表现出显着的相互作用，其次是中性粒细胞和 CD8T 细胞（图 2A 和 S3A）。因此，我们通过敲低原代 CAFs 的每个 BA 受体并评估 CM 对 CCA 细胞侵袭的功能来检测 CAF 衍生的条件培养基 （CM） 对 CCA 细胞的影响。在所有 BA 受体中，只有 GPBAR1 敲低 （KD） 表现出 CCA 细胞侵袭的显着降低 （图 S3B）。来自 CCA CAF 的 INT777 处理的 CM 显着增强了 CCA 细胞的迁移、侵袭和 EMT，对增殖的影响要弱得多。相比之下，CAFs 中的 GPBAR1 敲低减弱了 CAF 衍生的 CM 诱导的迁移、侵袭和 EMT（图 2B、S3C 和 S3D）。为了探索体内相关性，我们通过将人 CCA 细胞系 TFK-1 和/或 GPBAR1-KO CAF 植入肝脏，在 NOD-SCID 小鼠中建立了原位 CCA 模型（图 S3E）
CAF 共注射显著增加肝内转移数量，CAFs 中 GPBAR1 敲除 （KO） 减轻了这种情况。CBDL 治疗或 CA 饮食增强了这种 CAF 诱导的转移并降低了小鼠的生存时间（图 2C、2D 和 S3F-S3G）。这些结果表明，CAFs 中的 GPBAR1 激活能够独立于免疫抑制促进 CCA 转移。
为了确定负责促进 CCA 侵袭的 CAFs 分泌的潜在生物激活剂，我们使用 Olink 蛋白质组学检测分泌蛋白的变化，并在使用 INT777 刺激对照 CAFs 或 GPBAR1-KD CAFs 后用 mRNA-seq 检测转录组的变化 （GSE272594，表 S4 和 S5）。 在 INT777 刺激和 GPBAR1-KD 后差异表达蛋白 （DEP） 和差异表达基因 （DEG） 的交集中，只有 CXCL10 和 CXCL11 显示出 INT777 刺激的上调和 GPBAR1 敲低的下调（图 2E）。此外，我们进一步验证了 CXCL10 的表达和分泌，而不是 CXCL11，受 INT777 和 GPBAR1 调节（图 2E）。在人和小鼠 CCA 组织中，CXCL10 在所有细胞类型中成纤维细胞中的表达最高（图 S3H）。此外，CXCL10 中和抗体和敲除减弱了 INT777 处理的 CAFs 中由 CM 引起的 CCA 迁移、侵袭和 EMT 的促进，表明 CXCL10 是 CAF-CCA 相互作用中的关键生物激活剂（图 2F）。
GPBAR1 在 CAF 中通过 GαscAMP-SOX4 轴诱导 CXCL10 表达
为了筛选负责 GPBAR1 诱导的 CXCL10 表达的蛋白质，我们将 CAFs 的 DEGs 与 INT777 刺激或 GPBAR1-KD 以及 JASPAR 中的预测转录因子 （TF） 数据库重叠 （https://jaspar.elixir.no/），该数据库筛选出了三个 TFs，包括 SOX4、FOSB 和 HES1（图 2G）。随后的 qPCR 和荧光素酶报告基因测定显示，SOX4 而不是 FOSB 或 HES1 调节 CAF 中的 CXCL10 转录和表达，并且 SOX4 或 CXCL10 的表达受 GPBAR1 调节，而不受其他 BA 受体调节（图 2H 和 S3I）。在原代 CAF 中，GPBAR1 敲低降低了 SOX4 和 CXCL10 的表达，而 GPBAR1 过表达 （OE） 增加了 SOX4 和 CXCL10 的表达（图 2I 和 S3J）。 SOX4 敲除减弱了 INT777 诱导的 CXCL10 表达并释放到培养基中（图 2J 和 S3K）。此外，cAMP 激活剂毛喉素增强了 INT777 诱导的 SOX4 表达，并因 PKA 抑制剂 PKI 14-22 酰胺而减轻，表明 GPBAR1 通过偶联 Gαs 信号传导上调了 SOX4 表达（图 2K）。此外，我们揭示了 SOX4 通过 ChIP 测定与 CXCL10 的启动子区相互作用（图 S3L），通过 JASPAR 预测 SOX4 在 CXCL10 启动子上的结合位点，然后鉴定出 1238 到 1231 的“AACAAAGG”作为结合序列
（I-K）GPBAR1 过表达或敲低 （I）、SOX4 敲除或 INT777 （30 μM） 刺激 （J） 或 INT777 （30 μM） 或 INT777 （10 μM） 处理后，iCCA 和 eCCA CAF 中 SOX4 和 CXCL10 的表达 （K）。
（L） 通过双荧光素酶报告基因测定 （n = 6） 鉴定 CXCL10 启动子的潜在结合位点。
（M） 通过 Pearson 分析分析 CCA 组织 CAFs 中 GPBAR1 和 CXCL10 表达的相关性。n.s. 表示不显著。*、** 和 *** 表示表示表示组之间的 P <分别为 0.05、0.01 和 0.001。使用单因素方差分析（B 左、C 右、E、F 和 H 以及 I 左）分析数据，然后进行 Tukey 事后检验。使用 Kaplan-Meier 曲线绘制 OS 曲线，并通过对数秩检验 （D） 评估组间的统计差异。数据表示为 ± SMART 的平均值。
另请参见图 S3。
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请在媒体上引用这篇文章： Huang et al.， 胆汁酸激活癌症相关成纤维细胞并诱导胆管癌免疫抑制微环境， 癌细胞 （2025）， https://doi.org/10.1016/j.ccell.2025.05.017
通过进行不同的截断和双荧光素酶测定（图 2L 和 S3M）。通过将 FAP 、 GPBAR1 和 CXCL10 与 IF 共染色，我们发现 CCA CAFs 中的 CXCL10 表达与 CAF 中的 GPBAR1 呈正相关（图 2M 和 S3N-S3O）。这些结果表明，GPBAR1 通过偶联 Gαs 和诱导 SOX4 表达来促进 CXCL10 表达。
CXCL10 通过 CXCR3-TRIB3-TWIST1 轴促进 EMT 和 CCA 细胞转移
CXCL10 与多种受体相互作用，包括 CXCR3、ACKR1、ACKR2 和 Toll 样受体 4 （TLR4）。我们人类 CCA 组织的 scRNAseq 数据，然后进行 qPCR 验证
显示，与肿瘤细胞中的其他受体相比，CXCR3 的表达水平显着升高（图 3A、S4A 和 S4B）。此外，与 CAFs 或正常胆汁细胞 HIBEpiC 相比，CCA 细胞表现出相对较高的 CXCR3 表达（图 S4C）。功能研究表明，CXCR3 敲低、CXCR3 抑制剂和 CXCL10 中和抗体均减弱了 CAF-CM 诱导的 CCA 迁移、侵袭和 CCA 细胞的 EMT（图 3B 和 S4D）。
为了筛选负责 CXCR3 介导的侵袭和 EMT 的下游效应子，我们在重组 CXCL10 刺激 （GSE272665） 后对 CCA 细胞进行了 mRNA-seq，然后将 DEGs 与与 CXCR3 表达呈正相关的上调基因的公共数据集整合
图 3.CAF 衍生的 CXCL10 通过 CXCR3-TRIB3-TWIST1 轴增强 CCA 细胞的 EMT
（A） CCA 细胞中已知 CXCL10 受体的 mRNA 水平，包括 CXCR3、ACKR1、ACKR2 和 TLR4 （n = 6）。
（B） 对照或 CXCR3 沉默的 CCA 细胞与来自 CAF 的 CM（是否预先用 INT777 处理）、CXCL10 中和抗体 （5 μg/mL）、AMG487 （1 μM） 一起孵育，然后检测迁移（左）（n = 6）、侵袭（中）（n = 6）和 EMT（右）。（C 和 D）通过 mRNA-seq （C） 筛选 rhCXCL10 （100 ng/mL） 刺激后上调的基因，并在 CXCR3 过表达后发生阳性变化，然后在 rhCXCL10 （100 ng/mL） 或 AMG487 （1 μM） 或 CXCR3-KD （D） 处理后的 CCA 细胞中进行 qPCR 验证 （n = 6）。
（E） 用 rhCXCL10 （100 ng/mL）、AMG487 （1 μM） 或 LY294002 （10 μM） 处理后 CCA 细胞中 PI3K 和 AKT 的磷酸化。
（F 和 G）对照或 TRIB3 沉默的 CCA 细胞在用 rhCXCL10 （100 ng/mL） 或 AMG487 （1 μM） 处理后 （n = 6） 的迁移、侵袭 （F） 和 EMT （G）。（H） 通过将 CXCR3 沉默的 TFK-1 和 CAFs （5：1） 注射到 NOD/SCID 小鼠的肝脏中（左图）来采用原位模型。通过生物发光成像和 H&E 染色 （n = 6） 检测肿瘤的辐射效率 （中） 和转移性结节的数量 （右）。
（I） 处理为 （H） 的小鼠的生存曲线 （n = 10）。
n.s. 表示不显著。表示指示组之间的 p < 0.001。使用单因素方差分析（A、B 左和中，D、F 和 H 中间和右）分析数据，然后进行 Tukey 事后检验。使用 Kaplan-Meier 曲线绘制 OS 曲线，并通过对数秩检验 （I） 评估组间的统计差异。数据表示为 ± SMART 的平均值。
另请参见图 S4。
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请在媒体上引用这篇文章： Huang et al.， 胆汁酸激活癌症相关成纤维细胞并诱导胆管癌免疫抑制微环境， 癌细胞 （2025）， https://doi.org/10.1016/j.ccell.2025.05.017
（GSE121945），导致 7 个重叠基因，其中在公共数据集 （GSE32225 和 TCGA） 中只有 TRIB3 始终受 CXCL10-CXCR3 轴的调节（图 3C、3D 和 S4E）。在 KEGG 分析中，PI3K-AKT 通路最富集于 CXCR3 过表达或 CXCL10 刺激（图 S4F），PI3K 抑制剂 LY294002 显著降低 CXCL10 诱导的 TRIB3 表达，证实了 PI3K-AKT 通路在 TRIB3 调节中的作用（图 3E 和 S4G）。这些发现表明 CXCR3 激活通过 PI3K-AKT 通路促进 TRIB3 表达。
先前的研究表明，TRIB3 通过积累 TWIST1 表达促进 EMT。在这里，我们表明 TRIB3 敲低或 CXCR3 抑制剂 AMG487 广泛减少了 CXCL10 诱导的 CCA 迁移和侵袭（图 3F 和 S4H-S4I）。在 CCA 细胞中，CXCL10 刺激促进 TWIST1 表达，并受到 TRIB3 敲低或 CXCR3 抑制剂的抑制。 TWIST1 敲除降低了 CXCL10 诱导的 EMT，表明 TWIST1 是由 CXCR3-TRIB3 轴介导的 EMT 的关键效应子（图 3G）。此外，在 NOD-SCID 小鼠的原位模型中，在 CCA 细胞中敲除 TRIB3 或 CXCR3 延长了小鼠的存活时间，并抑制了通过 CAF 共注射、CA 饮食或 CBDL 治疗增强的转移（图 3H、3I 和 S4J-S4K）。
CAF 衍生的 CXCL10 是中性粒细胞募集到 CCA 微环境所必需的
如图 1B 所示，观察到高 BA 与免疫抑制之间存在显著相关性。 为了研究其机制，通过注射 LD1 以及施用 CBDL 和 CXCL10 中和抗体在 WT 或 Gpbar1 小鼠中建立原位模型 （图 4A 和 S5A）。CXCL10 中和抗体和 GPBAR1 缺陷均减轻了 CBDL 诱导的肿瘤转移和生长（图 4B）。为了评估 GPBAR1 缺陷引起的 CCA 免疫微环境的变化，对原位肿瘤进行了 scRNA-seq 分析，显示 CBDL 显着增加了瘤内中性粒细胞的百分比，而 CXCL10 中和抗体或 GPBAR1 缺乏降低了肿瘤内中性粒细胞的百分比（图 4C、4D 和 S5B）。FCM 和 IHC 的检测进一步证实了中性粒细胞百分比的这种变化（图 4E 和 S5C-S5F）。在临床 CCA 标本中，CD66b 测量的瘤内中性粒细胞与血清总 BA 、 GPBAR1 表达和 CXCL10 表达呈正相关 （图 4F 和 4G）。这些结果表明，升高的 BAs 募集依赖于 GPBAR1CXCL10 轴受累的中性粒细胞。
为了评估中性粒细胞是否归因于 CCA 进展，我们在 LD1 注射模型中用抗 LY6G 清除中性粒细胞，以 CXCR3-KO LD1 作为对照。与 CXCR3-KO 相比，抗 LY6G 治疗显著降低了肿瘤重量和转移，提高了小鼠的生存时间，表明中性粒细胞在 CCA 进展中起着更重要的作用（图 4H-4J 和 S5G-S5H）。
TLR4 介导 CXCL10 诱导的 CCA 中性粒细胞募集
为了研究 CXCL10 诱导的中性粒细胞募集的潜在机制，我们比较了已知的
使用 scRNA-seq 数据，在人 CCA 组织和小鼠原位肿瘤的中性粒细胞中包括 ACKR1、ACKR2、CXCR3 和 TLR4 的 CXCL10 受体。在这些受体中，TLR4 在 CCA 的瘤内中性粒细胞中表达最丰富 （图 5A）。此外，来自人和小鼠 CCA 组织的中性粒细胞中的 TLR4 表达在所有细胞类型中最高（图 S6A）。此外，外周血和肿瘤邻近组织中性粒细胞中的 TLR4 表达也显著高于 CCA 细胞系（图 S6B）。
为了研究中性粒细胞 TLR4 在 CCA 进展中的作用，我们采用了 Ly6G; 中性粒细胞中 TLR4 条件敲除的 TLR4 小鼠 （以下简称 TLR4-cKO） （图 S6C）。在 CXCL10 中和抗体、CXCR3 抑制剂 AMG487 或 TLR4 抑制剂 CLI095 存在下共培养从 Tlr4 小鼠和 TLR4-cKO 小鼠中提取的原代 CAFs 和中性粒细胞。 TLR4-cKO、CXCL10 中和抗体和 CLI095 有效阻断了 CXCL10 对中性粒细胞的趋化作用，而 AMG487 的作用明显减弱（图 5B 和 S6D）。在 CCA 患者的中性粒细胞中也观察到类似的结果，这表明 CAF-CXCL10 介导的中性粒细胞募集需要 TLR4（图 5B 和 S6D）。为了模拟 CAF 诱导的中性粒细胞募集，我们将来自人 CCA 组织和原代 CAFs 的中性粒细胞加载到对面的孔中，以观察中性粒细胞的运动轨迹。在该测定中，中性粒细胞表现出对原代 CAF 的定向趋化性，其在 CAF 中过表达 INT777 或 GPBAR1 增强，并受到 CXCL10 中和抗体或 TLR4 抑制剂 CLI095 的损害（图 5C、S6E 和 S6F）。
为了进一步评估 CAF 介导的体内中性粒细胞募集，将 CAFs 移植到中性粒细胞转基因斑马鱼 （lyzc：dsRed） 的卵黄中，以观察中性粒细胞从全身募集到 CAFs 注射部位的情况。结果表明，INT777 和 GPBAR1 过表达促进了中性粒细胞向 CAFs 的募集，而 GPBAR1 敲低、CXCL10 中和抗体或 TLR4 抑制剂则减少了中性粒细胞的募集（图 5D）。此外，进行了中性粒细胞转移实验，以显示 TLR4 在 CXCL10 介导的体内中性粒细胞募集中的作用。我们从 Tlr4 或 TLR4-cKO 小鼠的肿瘤中分离出中性粒细胞，用 CSFE 染色，然后将 CSFE 染色的中性粒细胞静脉再输注到载有 CXCL10 负载肿瘤的小鼠中，然后用 FCM 检测受体小鼠的瘤内中性粒细胞。CSFE 染色的中性粒细胞代表从外周血中募集的中性粒细胞，表明与 TLR4-cKO 小鼠相比，来自 Tlr4 小鼠的中性粒细胞募集更多（图 5E 和 S6G）。
在人 CCA 组织中，提取瘤内中性粒细胞，并使用 qPCR 检测 TLR4 表达。与血清 BA 和 GPBAR1 表达低的患者相比，血清 BA 和 GPBAR1 表达高的患者瘤内中性粒细胞 TLR4 表达更高（图 5F）。总的来说，这些结果表明 GPBAR1CAFs 通过 CXCL10-TLR4 轴募集中性粒细胞。
中性粒细胞浸润促进 CCA 中的免疫抑制
为研究浸润中性粒细胞的功能，采用 CCA 原位模型，将 LD1 注射到肝脏中
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图 4.CAF 衍生的 CXCL10 对于中性粒细胞募集到 CCA 微环境至关重要
（A） 肝内注射 LD1 和 CBDL 和 CXCL10 中和抗体处理的 WT 或 Gpbar1 小鼠的原位模型 （200 μg 每 3 天一次，ip.）（n = 6） 的 URL 中。
（B） （A） 中全肝肿瘤重量（左）与转移性结节（右）的比率 （n = 6）。
（C） tSNE 图显示小鼠原位模型中的免疫细胞簇。
（D） （C） 中不同免疫细胞亚型在总免疫细胞中的比例。
（E） FCM 检测到的小鼠原位模型中 CD45 细胞中中性粒细胞 （LY6GCD11b） 的比例 （n = 6）。
（F） CD66b IHC 染色检测 BA 水平高低的 CCA 患者肿瘤组织中中性粒细胞（左），Pearson 相关性检验分析 CD66b IHC 评分与血清 BA 水平的相关性（右）。
（G） Pearson 相关性分析中 CD66b IHC 评分与 GPBAR1 或 CXCL10 IHC 评分的相关性分析。
（H） 通过将 LD1 或 LD1 细胞注射到小鼠肝脏中，有/没有 LY6G 抗体处理 （12.5 μg/d， ip.） 来建立原位模型。（I） 生物发光成像中辐射效率的量化（左）、肿瘤重量的比率（中）和转移性结节的数量（右）（H） （n = 6）。
（J） 处理为 （H） 的小鼠的总生存曲线 （n = 10）。
n.s. 表示不显著。* 和 *** 分别表示指示组之间的 P < 0.05 和 0.001。使用单因素方差分析（B、D、E、H 右和 I）分析数据，然后进行 Tukey 事后检验。使用 Kaplan-Meier 曲线绘制 OS 曲线，并通过对数秩检验 （J） 评估组间的统计差异。数据表示为 ± SMART 的平均值。
另请参见图 S5。
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图 5.TLR4 是 CXCL10 诱导的中性粒细胞募集的负责受体
（A） 小鼠 （n = 10） 和人 （n = 19） CCA 组织（左）的 scRNA-seq 数据中中性粒细胞中 CXCL10 受体的表达水平，以及小鼠原位 CCA 模型和人 CCA 组织 （n = 6） 的 qPCR 验证（右）。（B） 在存在或不存在 AMG487 （1 μM）、CLI095 （100 nM） 或 CXCL10 中和抗体 （5 μg/mL） 的情况下，在上腔室用小鼠（左）或人（右）的 PBN 检测中性粒细胞趋化性，在下腔室检测来自 Tlr4 和 TLR4-cKO 小鼠（左）或人 CCA 组织（右）的原代 CAF。
（C） 琼脂糖趋化性下测定，以验证中性粒细胞向原代 CAFs 迁移的能力（左）。在 INT777 （30 μM） 或 CLI095 （100 nM） 的处理中，人 PBN 和 GPBAR1 沉默或过表达的 CAFs 位于琼脂糖的另一侧 2 小时。中性粒细胞的迁移轨迹（中）和趋化性通过计算迁移距离 （n = 10） 来评估趋化性（右）。
（D） 通过钙黄绿素 （绿色） 追踪原代 CAFs，然后接种到中性粒细胞转基因斑马鱼 （lyzc：dsRed） 的卵黄中。通过向斑马鱼卵黄募集中性粒细胞来评估中性粒细胞对原代 CAFs 的趋化性。
（图例在下一页继续）
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Tlr4 和 TLR4-cKO 小鼠，与载有 CXCL10 的水凝胶结合以实现可持续的 CXCL10 释放（图 5G）。CXCL10 促进原位肿瘤的生长和转移、瘤内中性粒细胞浸润和耗竭 T 细胞百分比，缩短小鼠的存活时间，这些都被 TLR4-cKO 或 LY6G 抗体逆转（图 5H、5I 和 S6H-S6K）。
在人 CCA 组织中，CD66b 的 IHC 评分与耗竭的 T 细胞百分比呈正相关（图 5J）。此外，瘤内 CD66b 与预后、肿瘤大小和远处转移显著相关 （图 5K 和 S6L;表 S3 和 S6）。这些结果表明，瘤内中性粒细胞浸润的增加促进了 CCA 的免疫抑制和肿瘤进展。
CAF 衍生的 CXCL10 通过抑制中性粒细胞分化来增加免疫抑制
在图 4A 所示的 scRNA-seq 数据中，中性粒细胞进一步分为五个不同的亚群（图 6A 和 S7A）。分化顺序的 CytoTRACE 分析显示，mN1 和 mN5 代表更不成熟的中性粒细胞亚群，而 mN3 是分化最严重的亚群（图 6B）。RNA 速度分析表明中性粒细胞分化轨迹遵循两种可能的轨迹： mN1→mN2→mN3 或 mN5→mN4→mN3 （图 6C）。CBDL 处理后 mN3 亚群的百分比降低，而随着 CXCL10 中和抗体的给药而增加，表明 CBDL 和 CXCL10 与中性粒细胞分化呈负相关（图 6C）。
为了验证这些发现，我们从小鼠原位肿瘤中分离原发性 CAFs 用于 CM 制备，并从外周血中提取中性粒细胞。使用 CM 孵育中性粒细胞不同的持续时间 （0-48 h），然后检测与 scRNA-seq 数据中鉴定的不同中性粒细胞亚群相对应的 mRNA 特征（图 6D;表 S7）。随着 CM 中培养时间的延长，中性粒细胞表现出未成熟亚群特征的表达增加，CXCL10 中和抗体减轻了这一点（图 6D）。此外，还通过将 LD1 细胞注射到小鼠肝脏中并培养 12 小时至 14 天，腹膜内施用 CXCL10 中和抗体来进行体内实验（图 6E）。随着肿瘤形成时间的延长，瘤内中性粒细胞表现出不成熟度增加，这被 CXCL10 中和抗体抑制了（图 6E）。这些结果表明，CCA 的 CAFs 抑制中性粒细胞分化，需要 CXCL10 参与。
先前的研究表明，未成熟的中性粒细胞有助于免疫抑制，TME.To 进一步研究未成熟中性粒细胞在 CCA TME 中的功能，我们通过将 Tlr4 小鼠的 TAN 转运到 Tlr4/TLR4-cKO 小鼠的肿瘤中进行了中性粒细胞拯救实验，外周血中性粒细胞 （PBN） 作为对照（图 6F）。与 TLR4-cKO 小鼠和空白水凝胶肿瘤中的 TAN 相比，来自负载 CXCL10 的水凝胶肿瘤的 TAN 表现出较低的 mN3 特征表达和 mN1 和 mN5 特征的高表达（图 S7B）。与 PBN 相比，在 Tlr4 小鼠中补充 TAN s 增加了 TLR4-cKO 小鼠的肿瘤转移、生长和免疫抑制，并缩短了小鼠的生存时间（图 6F-6H 和 S7C-S7G）。
在从人 CCA 组织提取的瘤内中性粒细胞中，检测到代表中性粒细胞成熟的基因，表明 BA 水平高的患者具有更多未成熟的瘤内中性粒细胞（图 6I 和 S7H;表 S8）。在图 6I 中，髓过氧化物酶 （MPO） 和中性粒细胞弹性蛋白酶（也称为 Elane）是众所周知的促肿瘤生物效应物，可以从中性粒细胞中释放出来。在从人和小鼠 CCA 组织中提取的 TAN 和 PBNs 培养基中，TAN 培养基中 MPO 和中性粒细胞弹性蛋白酶的浓度显著高于 PBN 培养基中的浓度（图 6J）。这些发现表明，CAF 诱导的中性粒细胞发育不成熟有助于 CCA 中的免疫抑制微环境。
GPBAR1 抑制增强 ICI 的抗肿瘤作用
CCA 对 ICI 治疗的不良反应仍不清楚。为了研究 BA 诱导的免疫抑制与 ICI 疗效之间的相关性，我们将 LD1 和细胞毒性 T 淋巴细胞 （CTL） 与小鼠 TAN 或 PBN 共培养。来自 CCA 的 TAN 在体外显着降低了 CTL 的抗肿瘤活性，而 PBNs 的作用很小（图 7A 和 S8A）。此外，小鼠 PBN 用 CAFs 的 CM 预处理，有/没有 GPBAR1-KO/CXCL10-KO 或 INT777 刺激。INT777 处理的 CAFs 与 PBNs 的共培养降低了 CTL 的抗肿瘤活性，CAFs 的 GPBAR1-KO/CXCL10-KO 恢复了这种活性（图 7B 和 S8B）。在用 CBDL、CA 饮食或 GPBAR1 抑制剂 SBI-115 处理的 Gpbar1 或 GPBAR1-cKO 小鼠中，从原位肿瘤中分离出 TAN，与 CTL 和 LD1 细胞共培养。 CLL 的肿瘤杀伤能力被 CBDL 处理小鼠的 TAN 更严重地抑制
（E） 从 Tlr4 或 TLR4-cKO 小鼠中分离 mPBNs，用 CFSE 标记，并静脉注射到负载 CXCL10 的水凝胶负担 CCA 肿瘤的小鼠中。用 FCM 检测中性粒细胞移植小鼠瘤内 CFSEneutrophils 的百分比 （n = 6）。
（F） 高血清 BAs （n = 8） 与低 BAs （n = 11） 或高 GPBAR1 （n = 9） 与低 GPBAR1 （n = 10） 的 CCA 患者 TAN 中 TLR4 的 mRNA 水平。（G） 在 Tlr4 或 TLR4-cKO 小鼠中注射有/没有 CXCL10 负载水凝胶 （1μg CXCL10） 的 LD1 细胞，并处理 LY6G 抗体 （12.5 μg/天，ip.），采用原位模型。
（H） （G） 原位肿瘤中的辐射效率、转移性结节的数量和中性粒细胞的比例。通过计算 FCM 中所有 CD45 细胞中的 LY6GCD11b 细胞来评估中性粒细胞的比例 （n = 6）。
（I） 处理为 （G） 的小鼠的生存曲线 （n = 10）。
（J） CCA 患者 CD66b IHC 评分与耗竭 CD8T 细胞比率之间的相关性。
（K） CD66b 在 CCA 中的预后意义。
n.s. 表示不显著。表示指示组之间的 p < 0.001。使用未配对的 t 检验 （E right 和 F） 或单因素方差分析和使用 Tukey 事后检验 （A、B、C right 和 H） 分析数据。使用 Kaplan-Meier 曲线绘制 OS 曲线，并通过对数秩检验评估组间的统计差异 （I 和 K 右）。数据表示为 ± SMART 的平均值。
另见图 S6。
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或 CA 饮食，如果 TAN 来自接受 GPBAR1-cKO 或 SBI-115 治疗的小鼠，则其影响会减轻（图 7C 和 S8C）。
此外，通过原位 LD1 CCA 模型和内源性 CCA 模型进一步评估小鼠 PD-1 抗体的抗肿瘤功效 floxed 小鼠和 GPBAR1/TLR4-cKO 小鼠，用 CBDL、高 CA 饮食和小鼠抗 PD-1 抗体处理 （图 S8D 和 S8F）。令人惊讶的是，CBDL 处理和 CA 饮食消除了对小鼠抗 PD-1 抗体的反应
而 TLR4cKO 或 GPBAR1-cKO 恢复了抗 PD-1 抗体的肿瘤抑制作用（图 7D-7I 和 S8D-S8G）。在 HTVi 递送的 AKT 和 YAP 质粒采用的内源性 CCA 模型中也观察到 TLR4-cKO 和 GPBAR1-cKO 的类似协同功能（图 S9A-S9D）。此外，唯一经 FDA 批准的 PD-1 抗体 （pembrolizumab） 治疗 CCA 的疗效在人源化 PD-1/PD-L1 小鼠中测试，治疗 CBDL、CA 饮食、SBI-115、CLI085 或 LY6G 中和抗体（图 7J、S9E 和 S9F）。帕博利珠单抗减少 CCA 进展的疗效
图 6.CAF 衍生的 CXCL10 通过抑制中性粒细胞分化促进免疫抑制 （A） 图 4A 中共有 5 簇中性粒细胞通过 UMAP 划分。
（B） 左：使用 CytoTRACE 分析中性粒细胞簇的分化电位和预测分化顺序。（C） 通过 RNA 速度分析预测中性粒细胞簇的分化轨迹 （上），并显示原位肿瘤中每个中性粒细胞簇的比例 （下）。（D） mPBNs 与含/不含 CXCL10 中和抗体 （5 μg/mL） 的小鼠 CCA CAFs 的 CM 一起孵育 0 至 48 小时，然后对不同中性粒细胞簇的标记基因进行 qPCR 检测 （n = 6）。（E） 将 LD1 细胞注射到小鼠肝脏中，培养 12 小时至 14 天，有/没有 CXCL10 中和抗体 （每 3 天 200 μg，ip.）。从肿瘤中分离 mTAN，用于代表不同中性粒细胞亚型的标志物的 qPCR 检测 （n = 6）。（F） 提取有/无 CXCL10 负载水凝胶 （1μg CXCL10） 的原位肿瘤的 mTAN，并与 LD1 细胞共注射到 Tlr4 和 TLR4-cKO 小鼠的肝脏中。显示了肝叶的病灶、生物发光成像中肿瘤的辐射效率、肿瘤在整个肝脏中的重量比以及 （F） 中转移性结节的数量 （n = 6）。
（G） （F） 中耗竭的 CD8T 细胞的比率 （n = 6）。
（H） 处理为 （F） 的小鼠的存活曲线 （n = 10）。
（I） 从不同血清 BA 水平的 CCA 患者中分离 TAN，qPCR 检测代表性中性粒细胞亚群标志基因的 mRNA（左）。分析 MPO 和 ARG1 表达与 CCA 患者 （n = 19） BA 水平之间的相关性 （右）。（J） 通过 ELISA 检测培养基中 MPO 的表达，并使用 N-甲基氧基琥珀酰-AlaAla-Pro-Val （n = 6） 的酶催化测量 NE 的活性。表示与指定组之间的 p < 0.001。使用未配对的 t 检验 （J） 或单因素方差分析和 Tukey 事后检验分析数据以进行多组比较 （F 右和 G）。使用 Kaplan-Meier 曲线绘制 OS 曲线，并通过对数秩检验 （H） 评估组间的统计差异。数据表示为 ± SMART 的平均值。
另见图 S7。
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被 CBDL 或 CA 饮食完全抑制，但被 SBI115、CLI085 或 LY6G 中和抗体改善（图 7J-7L）。在没有 CBDL 或 CA 饮食的情况下，GPBAR1 抑制剂 SBI-115 略微增强了 pembrolizumab 的效果。在 CBDL 或 CA 饮食的情况下，SBI-115/CLI085/抗 LY6G 增强 pembrolizumab 肿瘤抑制作用的协同作用广泛增加。
此外，一组 52 名接受抗 PD1/PD-L1 治疗的患者显示，血清 BA 水平低的患者的 OS 明显长于 BA 水平高的患者（图 7M 和 S9G;表 S9）。这些发现表明，BA-GPBAR1 轴会降低抗 PD1/PD-L1 的疗效，抑制 GPBAR1 可能会增强 ICI 治疗结果。
讨论
据报道，BAs 在调节 T 细胞生理过程中的免疫调节作用。然而，BA 对 TME 中其他细胞的影响以及 BA 受体在这些过程中的作用仍然研究不足。在这项研究中，我们系统研究了 CCA 微环境中各种细胞类型中不同 BA 受体的表达，并确定 GPBAR1 是 CAFs 中特异性上调的 BA 受体。我们发现 CAFs 中的 BA-GPBAR1-CXCL10 轴 （1） 通过诱导 TRIB3 和下游 TWIST1 表达增加 EMT 和 CCA 细胞的转移，以及 （2） 将中性粒细胞募集到 TME 中并增强瘤内细胞的不成熟度
图 7.GPBAR1 抑制增强 ICI 的抗肿瘤作用
（A） 从脾脏中提取小鼠 CD8T 细胞，并用 CD3 和 CD28 抗体刺激诱导 CTL。将 CTLs 与 LD1 、 TAN 或 PBN 共培养 48 h，然后通过结晶紫染色检测 LD1 活力 （n = 6）。（B） 小鼠 CTLs 与 LD1 和 mPBN 共培养，以刺激 GPBAR1-KO 、 CXCL10-KO 或 INT777 处理的 CAFs 的 CM。共培养 48 小时后 LD1 细胞的活力 （n = 6）。（C） 从 Gpbar1 或 GPBAR1-cKO 小鼠的原位肿瘤中提取 TAN，这些小鼠用 CBDL、CA 饮食或 SBI-115 （10 mg/kg， ip.） 处理，然后与 CTLs 细胞和 LD1 细胞共培养，然后检测 LD1 活力 （n = 6）。（D 和 E）采用原位模型，将 LD1 注射到 Gpbar1 或 GPBAR1-cKO 小鼠 （D）、Tlr4 或 TLR4-cKO 小鼠 （E） 的肝脏中，然后用 CBDL 或 CA 饮食处理有/没有抗 PD-1 （200 μg 每隔一天，ip.）。
（F 和 G）肿瘤的辐射效率、肿瘤占整个肝脏重量的比率以及 （D） 和 （E） 中转移性结节的数量 （n = 6）。
（H 和 I）处理为 （D） 和 （E） （n = 10） 的小鼠的存活曲线。
（J） 通过 HTVi 人源化 PD-1/PD-L1 小鼠注射 AKT 和 YAP 质粒，用于内源性 CCA 模型，然后处理 CBDL 或 CA 饮食、帕博利珠单抗（5 mg/kg 每隔一天，ip.）、抗 LY6G（每天 12.5 μg，ip.）、SBI-115（10 mg/kg，ip.）或 CLI095（10mg/kg，ip.）。通过 H&E 染色显示肿瘤。
（K） H&E 染色中的肿瘤面积和 （J） 中的肿瘤数量 （n = 6）。
（L） 处理为 （J） 的小鼠的存活曲线 （n = 10）。
（M） 接受 ICI 治疗的 CCA 患者的 OS 曲线按血清 BA 水平分层。
n.s. 表示不显著。*、** 和 *** 表示表示组之间的 P < 0.05、0.01 和 0.001。使用 Tukey 事后检验 （A、B、C right、E 和 H） 的单因素方差分析分析数据。使用 Kaplan-Meier 曲线绘制 OS 曲线，并通过对数秩检验 （F、I 和 J） 计算组间的统计差异。数据表示为 ± SMART 的平均值。
另见图 S8。
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中性粒细胞，这增加了免疫抑制。此外，我们的研究表明，CAF 中高水平的 BAs 或 GPBAR1 与 pembrolizumab 疗效降低相关，并且 GPBAR1 抑制增强了临床前模型中的 ICI 反应，提出了一种潜在的方法对 pembrolizumab 治疗的益处人群进行分层并提高 CCA 中抗 PD-1 治疗的疗效。
成纤维细胞具有高度异质性和可塑性，而 TME 的复杂性极大地增加了这种异质性，这导致在不同情况下没有公认的适合 CAFs 作为 Cre 靶标的遗传标记。在我们的研究中，S100a4（也称为成纤维细胞特异性蛋白 1，FSP1）在 CCA CAF 中用作 GPBAR1-cKO 的 Cre 靶标，具有相当的敲除效率，但它也可能在其他细胞类型中表达。此外，尽管我们通过 cKO 纵 GPBAR1 表达，并通过 Gpbar1 质粒和 HTVi 确保 GPBAR1 在肝脏成纤维细胞中过表达，但很难追踪成纤维细胞资源，因为没有特异性生物标志物来区分肝脏和胆道成纤维细胞。然而，这是一个有趣的话题，因为来自肝脏或肝内胆管的 CAF 在 CCA 肿瘤发生和进展的不同阶段可能具有不同的功能。几种 CAF 靶向疗法，包括直接消耗 CAF 或抑制 CAF 活化的疗法，已作为免疫疗法的补充应用于临床和临床前研究。然而，缺乏可成药靶点是靶向 CAF 的主要挑战。我们的研究表明，有抑制剂的 GPBAR1 成为治疗 CCA 和提高抗 PD-1 疗效的有前途的治疗靶点。我们以前的研究通过揭示其复杂的结构及其配体来表明 GPBAR1 的药学价值;同时，这项研究强调了其改善免疫治疗结果的潜力。有趣的是，GPBAR1 在 CCA 的 CAFs 中特别上调，并且尽管 CAF 存在异质性，但在几乎所有 CAF 亚型中都广泛表达。 GPBAR1 抑制剂 SB115 已在多种临床前模型（例如具有内源性 CCA 的人源化小鼠）中显示出治疗效果。所有这些结果表明，靶向 GPBAR1 治疗 CCA 和促进免疫治疗的有效性具有广阔的前景。然而，GPBAR1 在 CCA 的 CAFs 中上调的机制仍不清楚。 我们显示了 CAFs 在 CCA 中的特异性上调，但在其他癌症或胆汁淤积性疾病中没有，这表明 GPBAR1 上调可能是由 CCA 的特殊微环境教育的。
尽管先前的临床研究表明高血中性粒细胞是胆道癌的不良预后标志物，但 CCA 中瘤内中性粒细胞的分子功能仍未得到充分研究。一般来说，中性粒细胞可以通过多种机制促进肿瘤进展。首先，瘤内中性粒细胞产生活性氧 （ROS） 和抗菌肽的能力降低，这损害了它们的直接杀瘤活性，同时促进了肿瘤细胞存活和增殖。其次，中性粒细胞通过分泌高水平的促炎细胞因子（如 IL-6 和 IL-8）来调节 TME，支持肿瘤血管生成并增强其他免疫抑制细胞（包括 Treg 和 MDSC）的募集。
它消耗细胞外精氨酸，从而抑制 T 细胞的细胞毒活性。此外，中性粒细胞胞外陷阱 （NETs） 可以物理保护肿瘤细胞免受免疫攻击，并通过促进癌细胞粘附和迁移来促进转移。在中性粒细胞中，未成熟的中性粒细胞通常被认为更具免疫抑制性，特别是因为它们的 ARG1、中性粒细胞弹性蛋白酶较高，MPO.In 我们的研究中，我们确定了两组未成熟的中性粒细胞，mN4 和 mN5，其特征是 ARG1、MPO 和中性粒细胞弹性蛋白酶 （Elane） 等标志物。MPO 和中性粒细胞弹性蛋白酶是 NETs 的关键成分，已被证明在各种癌症中起着促肿瘤和免疫抑制作用。这些未成熟的中性粒细胞可能通过多种途径通过这些机制发挥免疫抑制作用，从而促进 CCA 的进展。
近年来，中性粒细胞异质性的重要性已得到广泛认可，但由于它们的寿命短、分化程度高且无法增殖，因此如何确定这种异质性仍不清楚。由于 TME 的复杂性，这个问题在 TME 中尤其具有挑战性。肿瘤来源信号导致中性粒细胞成熟状态多样性的机制仍然难以捉摸。从特定环境和微环境中得出了几个结论。 例如，CXCL12-CXCR4 信号通路对于中性粒细胞前体在骨髓中的保留至关重要，但另一方面，CXCR4 介导的信号对于中性粒细胞分化来说是必不可少的。此外，以前大多数关于中性粒细胞的研究都集中在中性粒细胞分化和动员发生的骨髓上，而不太强调理解 TME 中中性粒细胞的重编程。在我们的研究中，我们的数据表明 CCA 微环境中的 GPBAR1CAFs 产生 CXCL10，它在 TME 的教育中募集中性粒细胞进行去分化，导致更不成熟的表型。然而，CXCL10 和 CAF 如何在 CCA 微环境中调节中性粒细胞成熟的分子机制仍不清楚，需要进一步研究。
资源可用性
牵头联系人
更多信息以及资源和试剂请求应直接发送至主要联系人 Yunfei Xu （xuyunfei1988@ 126.com） 并由其提供。
材料可用性
本研究中生成的质粒和细胞系可从已完成的材料转让协议的铅联系人处获得。
数据和代码可用性
•
本文不报道原始代码。
•
所有新生成的 RNA 测序数据都已存入序列读取档案 （SRA） 中，入藏号列在关键资源表中。
确认
本工作由国家重点研发计划（2022YFA1104003）、国家自然科学基金（T2422013）、山东省重点研发计划（2021CXGC011105）、山东省自然科学基金资助
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请在媒体上引用这篇文章： Huang et al.， 胆汁酸激活癌症相关成纤维细胞并诱导胆管癌免疫抑制微环境， 癌细胞 （2025）， https://doi.org/10.1016/j.ccell.2025.05.017
（ZR2024JQ034、ZR2022YQ67）、山东大学齐鲁医院（青岛）柔性人才引导项目（QDKY2022RX03）和齐鲁青年学者计划。单细胞 RNA 测序数据 （GSE282701） 由中国科学院深圳先进技术研究院的 Shao 博士慷慨提供。
作者贡献
F.H.、Z.L. 和 Y.S. 进行了实验，分析了数据，准备了手稿。Y.X.、Z.Z.、W.J. 和 CP 领导了该项目，设计了研究，指导分析，并修改了手稿。A.S.、Y.S.、S.H.、G.W.、S.L. 和 F.Y. 协助进行实验。 K.L. 和 Y.T. 提供了测序数据集。T.C.、A.S.、Y.S.、F.H.、L.J. 和 Z.L. 收集标本并进行随访。Z.Z.、Y.X.、Z.L. 和 W.J. 提供资源并进行监督，所有作者都已查看并评论了手稿。
利益申报
作者声明没有利益冲突。
★STAR 方法
本文的在线版本提供了详细的方法，包括以下内容：
•
关键资源表
•
实验模型和主题详细信息
○
CCA 队列
○
人胆汁和血清样品
○
原代 CAF 分离和培养
○
动物
○
内生模式
○
原位 CCA 植入模型
○
中性粒细胞 CFSE 染色和回输
○
斑马鱼模型中的中性粒细胞趋化性
○
中性粒细胞分离和培养
○
中性粒细胞采用实验
○
CD8T 细胞分离和共培养
•
方法详细信息
○
免疫组化和评分
○
免疫荧光染色
○
RNA 分离和 qPCR
○
Western 印迹
○
过表达和敲低
○
CAF 的条件培养基
○
CCK8 检测
○
迁移和侵袭试验
○
双荧光素酶报告基因检测
○
ChIP-qPCR 检测
○
ELISA 检测
○
GloSensor cAMP 检测
○
中性粒细胞趋化性测定
○
琼脂糖细胞迁移检测
○
Olink 蛋白质组学
○
mRNA 测序
○
分离肿瘤间质液
○
总胆汁酸检测
○
胆汁酸分析的质谱分析
○
单细胞 mRNA 测序和分析
○
流式细胞术分析
○
泛癌种 scRNA 测序数据
○
CytoTRACE 和 RNA 速度
○
细胞间相互作用分析
○
单细胞拷贝数变异分析
○
FACS 实验
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NE 和 MPO 测量
•
量化和统计分析
○
统计分析
补充信息
补充信息可在 https://doi.org/10.1016/j 在线找到。
ccell.2025.05.017 的。
收稿日期： 2024 年 9 月 02 日 修回日期： 2025 年 2 月 10 日 录用日期： 2025 年 5 月 30 日
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