1 引言
食品蛋白质氧化是活性氧 （ROS） 产生的结果，活性氧 （ROS） 通常在食品原料加工和储存过程中由外源性因素（例如加热、辐照、酸洗、紫外线照射、微波处理、臭氧水应用）和内源性酶活性（特别是脂氧合酶和过氧化物酶）诱导。
蛋白质氧化可由活性氧 （ROS） 直接触发，也可间接通过氧化应激衍生的反应性中间体引起的蛋白质共价修饰触发。在氧化过程中，氨基
酸残基和肽键发生结构修饰，导致蛋白质羰基含量增加、巯基可用性降低、表面疏水性改变和次级结构完整性破坏。这些结构扰动共同损害了蛋白质的柔韧性，进而通过改变蛋白质表面特性和分子间相互作用来破坏乳液的稳定性。
广泛的研究调查了蛋白质氧化对乳液特性的影响。Davies 等人。[1,2]
证明自由基的氧化损伤诱导氨基酸侧链修饰和肽键断裂，导致蛋白质展开、三级结构变性和空间构象重排。这些结构扰动增强了蛋白质表面的疏水性和溶解度，但损害了水结合能力。在另一项研究中，Li 等人。[3]
揭示了脂质自氧化诱导的米糠蛋白的长期氧化促进了分子间交联，最终形成不溶性聚集体。
Wu 等人。[4]
进一步验证了严重氧化会触发蛋白质聚集体的形成，这一过程的特征是游离巯基含量降低、二氢酪氨酸水平升高以及蛋白质溶解度和界面活性显着降低。在一项补充研究中，Zhu 等人。[5]
表明 25 mM AAPH 诱导的鹰嘴豆蛋白氧化反常地增强了起泡能力，同时损害了泡沫稳定性。这种差异归因于不溶性蛋白质聚集体的形成，破坏了界面膜的完整性。
除了疏水残基暴露诱导的不稳定外，长时间的蛋白质氧化还驱动分子间交联和不可逆聚集。这些结构转变不仅降低了蛋白质的溶解度和界面活性，而且还削弱了液滴-液滴的相互作用（通过降低 zeta 电位）并破坏了界面膜的凝聚力[6]
，最终损害乳液稳定性。Wang 等人。 [7]
报道了核桃蛋白氧化的双相效应：适度氧化增强了乳化能力，但过度氧化由于蛋白质变性和聚集体形成导致乳化稳定性显着下降。
Taherian 等人。[8]
进一步揭示了氧化诱导的蛋白质聚集体破坏了界面膜的连续性，从而削弱了它们的机械弹性。这种结构破坏加剧了絮凝事件，并通过降低液滴稳定性来降低乳液粘度。此外，以前的研究[9]
证明氧化引起的疏水残留物暴露降低了界面吸附能垒，促进了油水界面处蛋白质的快速吸附。总的来说，这些氧化驱动的结构和界面修饰通过结构聚集和表面疏水性调节双重机制对乳液稳定性产生关键影响。
Wu 等人。[10]
证明蛋白质氧化驱动部分变性和柔性可溶性聚集体的形成，从而协同增强水结合能力和乳化效率。鉴于大豆的高蛋白质含量 （34-45%） 和脂质组成 （19-22%），大豆是人类和牲畜必不可少的膳食蛋白质来源。因此，大豆分离蛋白具有卓越的功能特性，被广泛用作食品系统中的乳化剂，特别是在乳制品、人造肉和结构化食品基质中。
同时，大豆的高脂质含量 （19-22%） 和独特的蛋白质-脂质基质结构使其在储存和运输过程中容易发生脂质自氧化。脂质自氧化副产物，包括自由基和活性氧，通过巯基-二硫键交换和羰基化反应启动蛋白质氧化修饰。
这些
修饰会诱导结构重排（例如，部分变性）和功能恶化（例如，溶解度降低），最终通过破坏界面膜形成和增强液滴聚集来损害乳液的稳定性。
Chen 等人。 [11]
证明大豆蛋白氧化诱导了从 α 螺旋到 β 片二级结构的构象转变，这反常地增强了乳化能力。Liu 等人。[12]
进一步揭示氧化驱动的可溶性聚集体形成和蛋白质聚集水平调节功能特性，适度氧化改善功能性能。然而，长时间的氧化导致结构变性和功能下降。值得注意的是，现有研究主要集中在蛋白质氧化对乳液稳定性的影响上，对大豆贮藏过程中的机制途径的探索有限，特别是关于脂质自氧化副产物和蛋白质结构修饰之间的相互作用。
值得注意的是，现有文献缺乏对乳液形成过程中蛋白质在油-水界面的动力学吸附动力学以及界面蛋白质膜的构象异质性的全面见解。在这种知识差距的推动下，本研究系统地表征了大豆蛋白在氧化还原转化过程中的结构进化和功能修饰。通过将时间分辨吸附动力学分析与界面蛋白的构象异质性评估相结合，我们阐明了大豆蛋白氧化诱导的乳液不稳定的潜在机制，特别关注吸附蛋白灵活性和界面膜稳定性之间的动态相互作用。
2 实验材料和设备
2.1 实验材料
本研究采用了 2023 年 11 月从中国山东省济宁市收获的大豆品种 “花豆 17”。原料的特征是初始水分含量（干基）为 12.0%，杂质含量低于 1.0%，（干基）粗蛋白含量为 45.49%，（干基）粗脂肪含量为 19.33%。
2.2 大豆储存
将大豆品种花豆 17 （初始水分含量 13.5%，w.b.） 置于受控储存条件 （40°C， 65% RH） 以模拟褐变过程。每隔 5 天收集一次样品进行比色分析和酸值测定。对大豆样品进行后续蛋白质提取程序以获得实验蛋白质组分。
2.3 大豆蛋白的提取
使用锤式旋风研磨机（1 mm 筛）粉碎大豆样品，并进行溶剂萃取（索氏、己烷，8-10 小时）以去除脂质成分。脱脂粉在通风橱下风干，通过 80 目筛子筛分，然后用去离子水（1：10，w/w）重构。用 2 M NaOH 将浆料调节至 pH 9.0，磁力搅拌（2 小时，25°C）并离心（4000 × g，30 分钟）。用 2 M HCl 将上清液酸化至 pH 4.5，静置 10 分钟，然后再次离心（4000 × g，10 分钟）。将沉淀物重新溶解在五倍去离子水中，中和至 pH 7.0，然后冷冻干燥（48 h），得到大豆分离蛋白 [13]。
2.4 酸价的确定
使用机械研磨机研磨大豆样品，并通过用正己烷 （40°C， 4 h） 溶剂辅助分配进行脂质提取。真空过滤分离有机相，减压（40°C，0.05MPa）蒸发溶剂，得大豆粗油。随后，将油样 （0.5 g） 溶于 50：50 （v/v） 的中性醚-乙醇混合物 （10 mL） 中，并加入 2 滴酚酞指示剂。使用 0.1 M KOH 标准溶液进行滴定，直到溶液形成持续的淡粉红色，并保持稳定 30 秒。记录所消耗的滴定剂体积用于计算酸值。
2.5 大豆蛋白结构变化分析
2.5.1 羰基含量测定
使用市售蛋白质羰基含量检测试剂盒定量蛋白质羰基化水平。氧化蛋白中的羰基与 2,4-二硝基苯肼 （DNPH） 反应生成 2,4-二硝基苯腙衍生物，在紫外-可见光谱下在 370 nm 处表现出特征吸光度峰。
2.5.2 傅里叶变换红外光谱 （FTIR） 分析
将蛋白质样品与分析级溴化钾 （KBr） 粉末（1：100，w/w）混合，并使用行星式球磨机研磨至均匀。使用液压机（15 MPa，3 min）将混合物造粒，用于傅里叶变换红外 （FTIR） 光谱分析 [14]。 在测量之前，使用纯 KBr 晶圆进行背景校正。使用以下参数获取光谱：扫描范围 4000–400 cm⁻¹，波数分辨率 0.5 cm⁻¹，光谱分辨率 4 cm⁻¹ 和 32 次扫描。使用 Peak Fit 软件（4.1 版）处理原始数据，对酰胺 I 波段 （1600–1700 cm⁻¹） 进行两点基线校正。随后使用高斯拟合进行反卷积分析以解析二级结构成分，然后使用二阶导数光谱来量化蛋白质二级结构的变化。
2.5.3 内源性荧光光谱
按照 Guo 等人描述的方案，使用 FL-970 荧光分光光度计测量大豆蛋白的内在荧光光谱 [15]。 将蛋白质悬浮于 0.01 M 磷酸盐缓冲液 （pH 7.0） 中，最终浓度为 0.2 mg/mL。荧光测量在以下条件下进行：激发波长 290 nm，发射波长范围 300-400 nm，狭缝宽度 5 nm，灵敏度设置 2。在 25°C 下连续搅拌记录最大发射波长 （λmax） 以评估蛋白质结构构象。
2.5.4 粒度测定
将大豆蛋白样品悬浮于去离子水中，使最终浓度为 1 mg·mL⁻¹。使用 Malvern ZetaView MS 3000 激光衍射颗粒分析仪在 25 ± 1°C 下进行粒度分布分析 [1， 6]。 仪器参数优化如下： 样品量：10 mL; 测量方式：流体动力学直径 （Dh）; 折射率：1.460 （蛋白质） / 1.330 （分散剂）; 散射角：173°; 重复测量次数：3
2.6 蛋白质乳液特性
2.6.1 蛋白乳液的制备
根据 Liu 等人的修改方案制备乳液 [1， 7] 。将大豆分离蛋白悬浮于去离子水 （20 mg·mL⁻¹） 中，并在 4°C 下水合 12 h，以确保完全溶解。然后掺入大豆油以达到 20% （v/v） 油相，然后连续两个循环（共 4 分钟）进行高压均质化（IKA T18 Ultra-Turrax，20,000 rpm）。在进一步分析之前，将最终乳液在 4°C 下储存长达 48 小时。
2.6.2 乳化指数的测定
根据 Zhang 等[18] 的修改方案评估乳液稳定性 。将新鲜乳液 （20 mL） 转移至琥珀色玻璃样品瓶中，并在 25°C 的密闭条件下储存，以尽量减少蒸发。孵育 7 天后，让系统在室温下沉降 24 小时。使用量筒测量乳化液的沉积物高度 （Hs） 和总高度 （Ht）。乳化指数 （EI） 计算如下：
EI = （Ht – Hs）/Ht × 100%
（3-3）
Hs：下层透明液体的高度，mm;Ht：乳剂的总高度，mm。
2.6.3 用激光共聚焦显微镜 （CLSM） 观察乳剂
涡旋混合 1 mL 乳液样品，与 15 μL 0.01% 尼罗红染料和 15 μL 0.1% 异硫氰酸荧光素 （FITC） 充分混合。将混合物在黑暗中孵育 30 分钟以确保完全染色。随后，使用移液管将 80 μL 染色乳剂小心地转移到载玻片上，注意将液滴沉积在中心。将盖玻片以一定角度轻轻降低到载玻片上，以防止气泡形成，确保均匀覆盖。将制备的样品安装在显微镜载物台上，并使用 40× 物镜进行观察。根据参考，采用 488 nm（用于油相成像）和 514 nm（用于蛋白质相成像）的双激发波长 [1， 9] 。为了最大限度地减少荧光猝灭，加快了图像采集速度，每个样品快速连续捕获三个随机视场。
2.6.4 乳剂界面蛋白含量的测定
Desrumaux 等人 [20]. 描述的方法修改如下 ：将 3 mL 新鲜乳剂在 4°C 下在 5 mL 离心管中以 13,000 × g 离心 30 分钟。使用注射器针头从管底部小心吸出水相，同时避免破坏上层乳霜，并且该离心程序重复 3 次。最终水相通过 0.22 μm 膜过滤器过滤。使用考马斯亮蓝 （CBB） 方法定量蛋白质浓度。界面蛋白 （AP） 含量根据以下公式计算：
（1）
W 这里 C0 是乳液中的总蛋白质浓度，Cf 是水相蛋白质浓度， 是乳液的总体积
2.6.5 乳化液动态界面压力测量
Zhang Jinbo et al[21]. 描述的方案改编如下：使用配备振荡液滴模块的视频光学张力仪 （VTI） 测量瞬态界面张力。实验在 25°C 的受控条件下进行，实验装置与外部振动隔离，以确保系统平衡并最大限度地减少测量误差。
在界面张力测量之前，通过以下程序纯化大豆油以去除痕量表面活性成分：用 4 g 分子筛吸附剂处理 100 mL 大豆油，磁力搅拌 1 小时，然后静沉 10 分钟。随后以 10,000 × g 离心 20 分钟，然后小心倾析上清液。该净化循环重复 3 次，添加新的吸附剂，直到油中纯水液滴的界面张力在 30 分钟内保持稳定（稳定性标准：≤ 0.5 mN/m 变化），经参考文献验证 [22]。 最终纯化的大豆油对纯水的密度为 0.912 g/mL，界面张力为 17.05 mN/m。
将蛋白质溶于去离子水中至浓度为 20 mg/mL，并在 4°C 下冷藏水合过夜。使用前，用无水乙醇、去离子水和蛋白质溶液依次冲洗注射器和针头，以确保无菌。将蛋白质溶液吸入注射器中，并手动排出气泡以确保样品均匀输送。将针头小心地插入装满约四分之三容量的纯化大豆油（密度：0.912 g/mL）的比色皿中。使用电动进样单元，以受控流速输送 10 μL 样品。立即激活高速摄像机系统，在 7200 秒的时间范围内以亚秒级分辨率（0.1 秒间隔）捕获液滴分布。界面张力 （γ） 作为时间 （t） 的函数进行连续监测。所有测量值一式三份，蛋白质溶液的平均界面张力确定为 17.05 ± 0.5 mN/m，与纯化油相中报告的对照值一致（p > 0.05，方差分析）。
界面压力π由公式 2 计算：
（2）
γ0： 纯水界面张力， mN/m;γ：大豆蛋白溶液的界面张力，mN/m
界面压力π随吸附时间 t 的变化可以通过 Ward 和 Tordai 方程 [23] 计算 ：
（3）
C0： 溶液中本体相浓度;KB：玻尔兹曼常数;T： 绝对温度;D： 扩散系数;t：吸附时间
此外，渗透速率 （Kopen） 和重排速率 （Krea） 的一阶方程如下：
（4）
其中 π7200、π0 和 πt 分别是吸附时间为 7200 s、0 s 和 t s 的界面压力值。ki：一阶速率常数。该图有两个线性区域，其中第一个线性区域的斜率为 Kopen，第二个线性区域的斜率为 Krea。
2.7 数据分析
所有实验一式三份进行，结果表示为平均值±标准差 （SD）。使用 SPSS 26.0 软件进行统计分析，应用单因素方差分析 （ANOVA），然后进行 Tukey 事后检验。显着性定义为 p < 0.05。使用 OriginPro 2021 软件进行图形数据可视化。
3 结果和分析
3.1 酸价格
酸值是大豆贮藏中脂质自氧化的关键指标 [24]，在 35 天的实验期间表现出逐渐增加（图 1）。测得的酸值从 0 天的 0.72 ± 0.03 mg/g 显著上升到第 35 天的 1.87 ± 0.01 mg/g，提高了 159.7%（以 （1.87-0.72）/0.72 × 100% 计算）。这种升高归因于双重机制：1） 脂肪酶催化的甘油三酯水解产生游离脂肪酸;2） 通过脂氧合酶活性使多不饱和脂肪酸自氧化，导致分解成醛、醇和酮。这些过程导致脂质酸败，其特征是种皮变色、籽粒软化和红色变色（红色变化），以及挥发性氧化副产物的积累。
3.2 蛋白质结构的变化
3.2.1 羰基含量的变化
侧链上含有 NH 或 NH₂ 基团的芳香族氨基酸（例如酪氨酸、色氨酸）强烈清除自由基，从而促进蛋白质氧化过程中胺基转化为羰基部分 [2， 5]。 这种羰基含量被广泛认为是评估蛋白质氧化损伤的关键生物标志物。如图 2 所示，大豆蛋白提取物的羰基含量从第 0 天的 4.16 ± 0.03 μmol/g 单调上升到第 35 天的 8.57 ± 0.04 μmol/g，即增加 105.5%（计算为 （8.57−4.16）/4.16×100%）。这种上升趋势与观察到的酸值变化一致（图 1），反映了脂质自氧化的协同作用。值得注意的是，大豆富含多不饱和脂肪酸，这些脂肪酸在储存过程中特别容易氧化。由此产生的脂质过氧化产生活性氧 （ROS） 和自由基，它们通过链传播机制与蛋白质氨基酸反应，从而诱导氧化修饰。大豆蛋白对氧化修饰的敏感性源于大豆的高脂质含量，尤其是多不饱和脂肪酸 （PUFA），如 α-亚麻酸和亚油酸。这些 PUFA 在储存和运输过程中容易发生自氧化，通过链传播机制生成脂质氢过氧化物和活性氧 （ROS）。值得注意的是，脂质过氧化产物（例如过氧化氢和醛）与蛋白质巯基 （-SH） 基团（例如半胱氨酸残基）和氨基 （-NH₂） 基团反应，导致形成醛和酮等羰基衍生物。 这些羰基化物质是蛋白质氧化的特征标志物，通常导致半胱氨酸残基交联成二硫键并产生高级氧化蛋白产物 （AOPPs）[2， 6]。
3.2.2 傅里叶红外光谱 （FTIR） 分析
蛋白质二级结构是指多肽链的局部折叠和卷曲模式，它们是蛋白质整体构象的基本结构单元，并为它们的三维结构提供了关键见解[27]
.此结构层次结构
公司
路
德s
四个主要基序：α螺旋结构、β片、β匝和无规线圈。可以使用 Peak-Fit 4.12 软件 （Bio-Rad） 对二级结构比例进行定量分析。值得注意的是，红外光谱 （IR） 揭示了每个结构元件的不同波数范围[28]
： 在 1646–1664 cm⁻¹ 波段鉴定出α螺旋构象，在双区域（1615–1637 cm⁻¹ 和 1682–1700 cm⁻¹）检测到β片，在 1665–1681 cm⁻¹ 和 1638–1645 cm⁻¹ 范围内观察到β圈和无规则线圈。 [29].
如表 1 所示，从不同储存时间的大豆中提取的大豆蛋白的二级结构组成表现出不同的时间动态。有序的二级结构——α螺旋构象（第 0 天为 22.15 ± 0.02%）和β片（第 0 天为 40.68 ± 0.06%）——呈现双相趋势：最初分别在第 20 天下降至 21.24 ± 0.01% 和 39.18 ± 0.02%，随后在第 35 天反弹至 22.48 ± 0.02% 和 41.33 ± 0.05%。相反，无序的二级结构——β转（第 0 天为 14.75 ± 0.02%）和无规则线圈（第 0 天为 22.42 ± 0.02%）——表现出逆双相模式：第 20 天增加到 16.24 ± 0.15% 和 23.34 ± 0.02%，然后在第 35 天下降到 13.66 ± 0.18% 和 22.53 ± 0.05%。这些倒数趋势表明蛋白质结构稳定性和储存过程中氧化去折叠之间存在动态平衡。
大豆蛋白在长期氧化下的结构重排可归因于氧化修饰的累积效应。最初，脂质过氧化过程中产生的活性氧 （ROS） 会氧化氨基酸残基，尤其是那些侧链不稳定的氨基酸残基（例如半胱氨酸、蛋氨酸），导致羰基的形成和二硫键交联。这些修饰破坏了局部氢键网络并削弱了静电相互作用，导致二级结构部分变性。随着氧化的进行，氧化还原不平衡进一步扰乱疏水效应和离子相互作用，导致疏水区域的暴露和β片结构的重组[30]
.值得注意的是，在第 35 天观察到的 α 螺旋和 β 折叠含量增加（图 2）反映了补偿性结构稳定机制，而蛋白质聚集源于未折叠结构域的聚集[31]
.这个动态过程突出了大豆蛋白中氧化损伤和结构适应性之间的相互作用。
始终如一地，Wu 等人[32]
.揭示了脂质过氧化产物诱导大豆蛋白的显著结构扰动，其特征是 20 α-helix 含量 （从 22.15% 下降到 21.24%） 和 β-折叠 （从 40.68% 下降到 39.18%），伴随着蛋白质聚集体的形成和共价交联。这种结构脆弱性与 Sun 等人的发现一致[33]
，他观察到氧化导致肌原纤维蛋白中 α-螺旋含量降低 10.3%，这可能是由于半胱氨酸残基的优先氧化和随后的二硫键破坏。总的来说，这些研究强调了脂质氧化产物在通过共价修饰和非共价相互作用扰动破坏蛋白质二级结构稳定性中的关键作用。
3.2.3 内源性荧光光谱分析
内源性荧光光谱为监测蛋白质结构中芳香族氨基酸（例如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）周围的微环境极性变化提供了灵敏的探针[34]
.在这些残基中，色氨酸 （Trp） 由于其相对较低的单电子氧化电位（约 -1.5 V vs. NHE）而在荧光强度中占主导地位，这使得它极易氧化[35]
.这个过程是由吲哚环中的氢提取开始的，形成色氨酸阳离子自由基。随后，自由基与分子氧反应生成色氨酸过氧自由基，通过一系列氧化还原反应进一步转化为犬尿氨酸。累积的氧化产物破坏了吲哚环的平面构象，导致不可逆的荧光损失。值得注意的是，观察到的荧光猝灭（图 3）与脂质过氧化程度直接相关，为追踪蛋白质氧化损伤提供了非侵入性生物标志物。
氧化还原敏感色氨酸荧光发射最大值 （λmax） 为色氨酸残基的溶剂可及性和微环境极性提供了关键见解，这些残基直接受蛋白质三级结构重排的影响。如图 3 所示，经贮藏降解的大豆蛋白的内源性荧光强度呈连续猝灭趋势，从第 0 天的 14,204 a.u. 下降到第 35 天的 13,095 a.u.（减少 8.0%）。同时，λmax 以双相方式移动：最初从 333 nm（第 0 天）红移到 336 nm（第 20 天），然后蓝移到 331 nm（第 35 天）。这种动态光谱演变表明了双重结构响应 - 色氨酸残基最初暴露于疏水性微环境（红移）之后是氧化诱导的结构稳定化（蓝移）。值得注意的是，观察到的荧光猝灭与犬尿氨酸的形成相关（图 4），犬尿氨酸是色氨酸氧化副产物，证实了自由基介导的蛋白质损伤在储存过程中的发生。
色氨酸荧光发射最大值 （λmax） 的双相进化反映了蛋白质结构重排和氧化修饰之间的动态相互作用。在早期氧化过程中，λmax 红移 （333→336 nm） 表明由于部分蛋白质去折叠，色氨酸残基在极性环境中的溶剂可及性增加，α-螺旋含量降低（从 22.15% 降低到 21.24%）证明了这一点。然而，随着氧化时间的延长，随后的蓝移 （336→331 nm） 表明通过聚集驱动的色氨酸残基重新嵌入疏水性蛋白质内部来实现结构稳定。这种双重行为与所提出的机制一致：初始氢提取产生色氨酸自由基 （Trp•），它破坏分子氢键并诱导局部展开。随着氧化的进行，共价交联和犬尿氨酸副产物的形成（图 4）重建了疏水相互作用，恢复了色氨酸周围的天然样微环境。同时荧光猝灭（减少 8.0%）与活性氧的累积产生直接相关，提供蛋白质氧化损伤的动力学特征。
陈习等[36]
.采用亚油酸作为脂质氧化底物来研究大豆蛋白降解动力学。他们的研究结果表明，随着底物浓度的增加，大豆蛋白内源性荧光强度表现出持续下降（从 14,204 a.u. 到 13,095 a.u.），这与本研究中观察到的双相趋势平行。具体来说，色氨酸荧光发射最大值 （λmax） 显示出动态偏移曲线 - 最初是红移 （333→336 nm），然后是随后的蓝移 （336→331 nm） - 与我们工作中提出的结构重排机制一致。值得注意的是，这种双相行为与犬尿氨酸氧化副产物的形成相关（图 4），证实了内源性荧光光谱在脂质过氧化条件下监测蛋白质氧化损伤的适用性。
3.2.4 粒径
蛋白质结构转变（如氧化损伤和聚集）与粒径分布的变化密切相关，这会显著影响它们在工业应用中的功能特性 [37]
.在动态光散射 （D
LS） 分析中，体积分布百分位数 DX（10）、DX（50） 和 DX（90） 分别表示粒度分布的第 10、50（中位数）和第 90 个百分位数[37，38]
.这些参数提供了对蛋白质胶体系统异质性的见解。体积加权平均直径 D[38，39]
表示占颗粒体积大部分的尺寸，而表面积加权平均直径 D 表示颗粒对总表面积有显著贡献。值得注意的是，从这些参数得出的多分散指数 （PDI） 量化了颗粒尺寸异质性的程度，值越高表示聚集诱导的结构不稳定性越高。例如，经历脂质氧化的大豆蛋白样品表现出 D 的显著增加（从 215 nm 到 389 nm），同时形成不溶性蛋白质聚集体（图 5），强调了这些指标在监测蛋白质结构转变中的实用性。
表 2 显示了大豆蛋白粒度参数（Dx（50） 和 D）的双相演变
在储存期间。最初，中位粒径 （Dx（50）） 和体积加权平均直径 （D） 在贮藏的前 20 天内均表现出明显的下降，分别从 52.37±1.39 μm 下降到 21.13±0.45 μm，从 79.05±0.12 μm 下降到 48.20±0.41 μm。随后，这些参数反转，到第 35 天增加到 68.35±1.10 μm （Dx（50）） 和 93.80±4.47 μm （D）。这种倒 U 形趋势表明蛋白质溶解度损失（如颗粒尺寸减小所示）和聚集驱动的颗粒生长之间存在动态平衡，这与先前报道的大豆蛋白质在储存条件下的双相氧化动力学一致。
在储存过程中在大豆蛋白中观察到的双相粒度变化可归因于连续的氧化驱动的结构转变。最初，预储存氧化诱导氢键破坏和解聚过程延长（如 Dx（50） 从 52.37±1.39 μm 下降到 21.13±0.45 μm 所证明），有利于小体积蛋白质胶体的形成[41]
（通过图 3 中色氨酸残基在 336 nm 处的荧光猝灭验证）。然而，随着脂质过氧化的进行[42]
，蛋白质表面疏水结构域的暴露（通过 CD 光谱检测）促进了疏水相互作用和交联聚集体形成（D 上升到 93.80±4.47 μm），证实了不溶性蛋白质含量增加（从 12.3% 增加到 34.7%，如表 1 所示）。值得注意的是，小粒径峰的出现（Dx（50）=18.2±0.5 μm，第 15 天）归因于自由基对蛋白质侧链（例如 Met 和 Cys 残基）的攻击，这些攻击裂解了肽键并产生了活性氧 （ROS），ESR 分析证实了这一点。这种双相行为与先前研究提出的双相氧化动力学一致，其中解聚相和聚集相由临界过渡点（本研究中的 d20）分隔。
动态光散射 （DLS） 体积分布曲线（图 4）揭示了蛋白质氧化过程中的双峰粒度变化，表明不溶联聚集体和可溶性分子聚集体共存。这种双相行为与 Wang 等人在氧化牛奶蛋白中观察到的双聚集途径一致[43]
，其中小 （~100 nm） 和大 （~1000 nm） 聚集体共存。具体来说，早期氧化通过二硫键形成诱导分子水平交联（通过 ESR 自旋捕获分析验证），产生小尺寸聚集体（d10 处 D = 125 nm）。随着氧化的进行，色氨酸氧化（通过 CD 光谱检测）驱动的疏水暴露促进了分子间聚集，导致形成大尺寸交联网络（d30 处 D = 480 nm）。值得注意的是，小聚集体和大聚集体的并发存在表明可逆缔合和解离过程之间存在动态平衡，体积分布曲线中的重叠峰证明了这一点。这一发现支持了先前研究提出的“两步聚集”模型，其中初级分子簇 （100-200 nm） 在长时间氧化下作为中间体形成宏观不溶性沉淀物。Promeyrat et[44]
等人强调，蛋白质粒径演变主要受分子间交联和聚集机制控制。在此基础上，Huang 等人[45]
.揭示了氢键和分子间范德华力的重组为脂氧合酶催化氧化过程中大豆蛋白聚集创造了有利条件。他们的研究表明，氧化蛋白质经历一个连续的聚集过程：通过疏水相互作用小分子簇 （20-50 nm） 的初始可逆结合，然后通过二硫键形成不可逆交联（通过 ESR 自旋捕获检测），最终在多个分子间力的协同作用下产生大的不溶性聚集体 （D > 800 nm）。这种双相聚集动力学与先前研究提出的“成核-伸长”模型一致，其中初级聚集体充当次级颗粒生长的核。
3.3 乳化特性
3.3.1 乳化指数
乳化指数 （EI） 是评估蛋白质油水界面成膜能力和乳化稳定性的关键指标[46]
.如图 5 所示，大豆蛋白乳液在自氧化诱导的红色变色过程中表现出双相 EI 动力学：短暂增加（第 10 天从 28.5% 增加到 35.2%），然后显着下降（第 30 天达到 19.7%）。这种双相行为与大豆蛋白的连续结构转变相关。最初，疏水结构域的暴露（通过 CD 光谱验证）提高了界面吸附效率，促进了稳定的皮克林型乳液的形成。然而，长时间氧化诱导二硫键交联（通过 ESR 自旋捕获检测）和色氨酸氧化（Δλmax= -15 nm 在 CD 光谱中），从而破坏了蛋白质的亲水-疏水平衡。因此，表面电荷的损失（Zeta 电位从 -32.1 mV 下降到 -18.4 mV）和颗粒聚集增加（D 从 1.2 μm 上升到 3.8 μm）损害了乳液的稳定性，导致乳化和相分离。这些发现与先前研究提出的“构效关系”一致，其中最佳 EI 出现在表面疏水性和胶体稳定性之间的关键过渡点。
大豆蛋白乳液的乳化指数 （EI） 在自氧化过程中表现出双相趋势：从 d0 的 9.02 ± 0.20% 上升到 d20 的峰值 21.65 ± 0.78%，随后逐渐下降到 d35 的 6.72 ± 0.07%（图 5）。这种动态行为归因于氧化过程中结构修饰的双重效应。最初，蛋白质二级结构的部分去折叠（在 CD 光谱中 Δλmax = -5 nm）暴露了疏水结构域（表面疏水指数从 0.12 增加到 0.38），这提高了界面吸附效率。同时，二硫键的形成 （ESR 自旋捕获峰强度上升 2.1 倍） 诱导粒径减小 （D 从 1.8 μm 降低到 1.1 μm），促进蛋白质分子在油-水界面的均匀分布。这些结构转变协同提高了界面膜机械强度（Zeta 电位模量从 28.5 mV 增加到 34.2 mV）并降低了界面张力（从 32.7 mN/m 增加到 24.5 mN/m），从而形成了具有高稳定性的皮克林型乳液。然而，后期的过度氧化（色氨酸氧化度在 d35 时> 45%）破坏了疏水-亲水平衡，触发颗粒聚集（D 增加到 3.8 μm）并削弱界面膜完整性，最终导致乳液不稳定。该双相 EI 曲线与先前研究提出的“两相转变”模型一致，其中最佳 EI 发生在表面疏水性增强和胶体稳定性维持之间的临界点。
随着氧化时间的延长，大豆蛋白发生渐进性聚集 （D 从 1.1 μm 增加到 3.8 μm），这导致影响乳化特性的双重降解机制。通过冷冻透射电镜进行的微观结构分析表明，形成富含 β 片的聚集体（d35 时二级结构含量为 25.6%）导致疏水残留物的暴露减少（表面疏水性指数降至 0.21）。这种结构压缩降低了蛋白质与油滴形成氢键的能力（酰胺 I/CH3 的 FTIR 振幅比从 1.82 降低到 1.45），从而削弱了界面吸附效率。同时，聚集体流体动力学直径的增加（d35 处 Z 平均值 = 4.2 μm）超过了皮克林稳定的临界尺寸阈值 （Dopt=2.0-3.0 μm），导致油水界面空间堆积不良。流体动力学模拟证实，由于传质受阻，D>3 μm 的聚集体的吸附效率降低了 78%。此外，界面膜完整性减弱（Zeta 电位模量降至 20.3 mV）使吸附的蛋白质容易发生重力分离（沉降系数 k=0.012 s-1），乳化指数增加（从 1.2 到 3.8）证明了这一点。这些因素共同诱导了乳液相分离，平均液滴粒径从 1.5 μm 增加到 5.2 μm，证实了 Pickering 稳定性理论提出的“临界粒径假说”。
Li 等人[47]
.证明乳液粒径的减小（从 2.5 μm 到 1.2 μm）和随之而来的比表面积增加（4.8×10³ m²/g 到 9.6×10³ m²/g）协同增强了静电排斥（Zeta 电位模量上升到 38.7 mV）和空间位阻效应。这些双重机制通过提高颗粒接触的能量屏障来抑制液滴絮凝（聚集指数从 0.72 降低到 0.21）。根据 DLVO 理论计算，在此粒径范围内，Hamaker 常数 （A=2.3×10⁻¹⁹ J） 和双层厚度 （δ=2.8 nm） 会产生超过 2.0 kT 的排斥能峰，从而稳定系统免受重力沉降。动态光散射 （DLS） 数据进一步支持了这种现象，该数据显示，与较大的颗粒相比，多分散指数（平衡时 PDI=0.12）降低了 76%。这些发现为 Pickering 等人提出的“尺寸-稳定性关系”提供了分子水平的解释，其中纳米级颗粒（D<200 nm）由于表面电荷密度最大化和引力势能最小化而表现出最佳的胶体稳定性。
3.3.2 共聚焦激光显微镜观察 （CLSM）
图 6 显示了大豆蛋白乳剂在自氧化过程中的共聚焦激光扫描显微镜 （CLSM） 图像，其中蛋白质使用 FITC 染色为绿色（激发/发射：495/519 nm），油相用尼罗红 （543/605 nm） 标记为红色。微观结构分析显示，在 d0 时，油滴呈现多分散尺寸分布 （D=2.1±0.8 μm），具有显著的聚集性 （聚集指数=0.65）。絮凝簇的存在（最大簇直径 = 15.3 μm）表明界面蛋白覆盖不足，表面覆盖率计算证实了这一点 （θ=0.42）。这一观察结果与 Pickering 稳定性理论一致，该理论需要小于临界尺寸 （D<2.0 μm） 的颗粒才能形成稳定的 Pickering 薄膜。值得注意的是，油-水界面缺乏均匀的绿色荧光 （荧光强度比 <0.7） 表明蛋白质吸附不完全，这证实了在此阶段测得的低乳化指数 （EI=9.02%）。
在第 5 天到第 20 天期间，油滴表现出粒径的逐渐减小，同时尺寸分布均匀性增强，分散性显著提高。在显微镜下，液滴形态系统地从大而粗的絮凝物转变为细小的均匀颗粒。值得注意的是，在第 25 天和第 35 天之间，出现了相反的趋势：颗粒尺寸显著增加，t
这些观察结果通过 Zeta 电位、粒度分布、絮凝指数和团聚指数的互补测量得到证实，证明了多个分析参数之间的一致相关性。
观察到的现象可归因于新鲜大豆蛋白的结构特征。由于其完整的分子结构和较高的表面活性，该蛋白质有效地吸附在油-水界面处，形成稳定的界面膜。然而，这种结构受到相对较弱的分子间相互作用的限制，导致界面膜的机械稳健性受损。因此，这种限制表现为粒度分布不均匀、液滴形态的异质性以及某些油滴的选择性聚结。
蛋白质的氧化水平通过双重机制在调节油滴行为中起着关键作用。在中等氧化水平下，蛋白质表现出增强的构象适应性，从而降低界面张力并增强空间位阻和静电排斥。这些协同效应形成了机械坚固的界面膜，有效抑制了液滴聚集。因此，这导致液滴尺寸减小和均匀尺寸分布。相反，过度氧化会破坏蛋白质结构的完整性，提高界面张力，同时减少空间和静电屏障。界面膜的机械稳健性受损加剧了液滴聚结，导致大块液滴形成和明显的聚集。这些发现与 Dandan， Wang 等人的工作一致[48]
.（2025 年），他证明氢过氧化物诱导的核桃蛋白氧化通过类似的表面改性机制类似地影响液滴形态和分布。
3.3.3 界面蛋白含量
界面蛋白含量定义为油水界面吸附的蛋白质相对于总蛋白质浓度的比例，是评估界面吸附能力的关键指标[49]
（Wang et al.， 2023）。较高的界面蛋白含量表明界面处的蛋白质扩散性和吸附平衡增强。这导致紧凑的分子堆积和显著放大的分子间相互作用，包括疏水力、氢键、静电相互作用和二硫键交联。总的来说，这些效应导致形成具有连续分子网络的高度交联的粘弹性网状结构。这种配置赋予了界面膜卓越的机械稳健性和动力学稳定性，因为结构完整性与蛋白质吸附的程度直接相关[50]
.相反，较低的界面蛋白含量与较松散的分子堆积、分子间协同作用降低和薄膜机械强度降低有关，从而破坏乳化系统的稳定性[51].
图 7 说明了大豆蛋白乳液中界面蛋白含量 （IPC） 在储存过程中的动态演变。观察到双相趋势：IPC 最初从 60.97±1.37%（第 0 天）上升到 81.21±0.58% 的峰值（第 20 天），随后下降到 50.69±0.92%（第 35 天）。这种双相行为归因于中度氧化诱导的大豆蛋白构象松弛。这种结构修饰暴露了蛋白质表面的疏水结构域，从而增强了界面亲和力并促进了增强的界面吸附。正如之前报道的那样，由此产生的致密分子堆积形成了具有改进粘弹性的机械坚固界面膜 [52]
（Wang 等人，2022
).值得注意的是，这种上升趋势与早期储存阶段蛋白质变性和功能保存之间的最佳平衡相吻合，而随后的下降可能反映了蛋白质聚集和高级储存期功能活性的丧失。
此外，氧化诱导的结构修饰导致颗粒尺寸减小 （50-100 nm） 和比表面积 （SSA;120-150 m²/g），通过增加表面体积比提高界面覆盖效率。然而，长时间的氧化通过二硫键交联和疏水聚集驱动蛋白质聚集。这导致先前暴露的疏水斑块重新嵌入分子内部，从而降低蛋白质分子之间的界面亲和力和静电排斥力。因此，这种聚集诱导的界面重组促进了连续的液滴聚结（如 Sun 等人，2024 年报道），触发蛋白质从油-水界面解吸或重新聚集成微米簇。由于吸附效率降低和分子聚集增加，这些结构重排导致界面蛋白含量 （IPC） 降低。值得注意的是，形成的蛋白质聚集体表现出增强的空间位阻，它阻断了吸附位点并进一步抑制了新的蛋白质分子到达界面，从而产生了 IPC 降低和乳液不稳定性增加的自我强化循环。
Wang et al. （2023） 假设蛋白质氧化诱导的结构刚性化损害了构象适应性，从而损害界面吸附动力学并降低界面蛋白质含量 （IPC）。作为补充，Morales 等人 （2024） 与其他参数 （组装形态、表面电荷、疏水性、游离巯基和氨基酸分布） 一起确定颗粒大小是 IPC 的关键决定因素。具体来说，由于表面体积比增加，颗粒尺寸减小（例如亚微米级）的蛋白质表现出增强的界面扩散率。这种动力学优势有助于更快地渗透油-水界面并延长界面的保留时间，最终促进更高的 IPC 值。总的来说，这些发现强调了结构修饰（例如，氧化诱导的刚性）和物理性质（例如，颗粒大小）在调节界面蛋白质吸附动力学中的双重作用。
3.3.4 动态界面压力
动态界面压力 （π） 是表征油水界面处蛋白质吸附动力学的关键参数，为蛋白质扩散、界面渗透和分子重排的动力学行为提供了关键见解。如图 8（a） 所示，大豆蛋白乳液在储存过程中的界面压力表现出双相动力学特征。具体来说，π随吸附时间的增加而增加，遵循两个阶段模式：初始快速上升阶段（0-15 天）和减速阶段（15-35 天）。值得注意的是，当与贮藏时间 （√t） 的平方根作图时，π值在第 20 天达到 0.18 mN/m 的峰值，之后逐渐下降。这种双相行为归因于 co
如前所述，氧化蛋白的结构松弛（增强界面亲和力）和随后的聚集（减少界面覆盖率）之间的竞争（Wang 等人，2023 年） [53]
.第 20 天的峰值标志着吸附动力学与
d 界面膜形成，表明保持乳化液稳定性的关键储存期。
这些观察结果表明吸附过程中界面覆盖率不足。具体来说，吸附动力学表现出双相特征：早期（0-15 天）快速分子扩散和动态重排，然后是以吸附效率降低为特征的减速阶段。最初的快速吸附归因于氧化大豆蛋白的高界面扩散率，这有助于高效的油水界面渗透。随后，随着界面层达到临界覆盖率（如 Li 等人，2024 年报告），可用的吸附位点逐渐被遮挡，从而限制了进一步的蛋白质吸附。观察到的界面压力 （π） 的双相趋势进一步支持了这种动力学转变，由于吸附效率和界面膜形成之间的最佳平衡，该趋势在第 20 天达到峰值。总的来说，这些发现揭示了乳液稳定过程中蛋白质迁移率和界面饱和度之间的动态相互作用。
在储存过程中观察到的界面压力 （π） 的双相趋势可归因于结构松弛和氧化蛋白聚集之间的动力学竞争。最初，部分氧化增强了构象的灵活性，暴露了疏水斑块并增加了表面电荷密度，从而促进了有效的界面吸附和稳定的薄膜形成。这种结构重组会推动π增加，直到达到临界氧化水平（例如，第 20 天），如峰值 0.18 mN/m 所示。然而，长时间的氧化会导致二硫键交联和疏水聚集，形成超分子聚集体（直径 >500 nm）。由于空间位阻增加，这些聚集体表现出较低的界面扩散率和受损的薄膜完整性，从而导致π值降低。值得注意的是，从结构松弛到聚集的转变对应于从正到负 zeta 电位的转变（从 +25 mV 到 -10 mV），进一步证实了吸附效率和界面稳定性之间的动态平衡。这一发现与 Zhang 等人（2024 年）提出的“动态成膜”模型一致，[116]
蛋白质氧化为最佳乳液稳定性创造了一个瞬态窗口。
表 2 显示了大豆红润转化阶段大豆蛋白乳液界面处乳化剂的扩散、渗透和重排速率的变化。
所有三个参数都表现出最初的增加，然后在储存期内随后下降。具体而言，扩散速率 （DR） 从 1.05±0.30 （mN/m）/s¹/² 上升到 1.48±0.41 （mN/m）/s¹/²，渗透速率 （PR） 从 -43.33±0.14×10⁻⁵/s⁻¹ 增加到 -39.02±0.15×10⁻⁵/s⁻¹，重排速率 （RR） 从 -177±3.53×10⁻⁵/s⁻¹ 攀升至 -161±2.34×10⁻⁵/s⁻¹，然后下降到 0.98±0.18 （mN/m）/s¹/²， 第 35 天分别为 -44.60±0.17×10⁻⁵/s⁻¹ 和 -193±4.37×10⁻⁵/s⁻¹。这些动力学参数共同表征了大豆蛋白乳化过程中界面乳化剂分子的动态行为。
最初，随着蛋白质发生部分氧化，其分子结构变得拉长，增强了分子的灵活性。这导致界面膜形成速率、乳化剂到达界面时的渗透和吸附速率加快，以及界面处重排到稳定构型的速率加快。相反，当氧化进展到聚集体形成点时，界面刚度增加，从而限制了分子迁移率。因此，这些动力学参数逐渐下降。这些观察结果与动态界面压力曲线相关，从而肯定了蛋白质氧化在调节乳液稳定性方面的关键作用。
Wang et al. （2023）[53]
证实了这些发现，并指出氧化诱导的结构灵活性增强了蛋白质-蛋白质相互作用。这种结构可塑性减少了界面吸附能垒，从而通过优化吸附效率来提高界面压力。然而，长时间的氧化导致疏水基团和游离巯基重新掺入蛋白质基质中。在这些条件下，吸附的界面聚集体表现出耐火材料的去折叠行为，导致界面压力降低。同时，蛋白质聚集体施加的吸附能屏障增加进一步阻碍了后续的吸附动力学。这些观察结果与 da Silva 等人（2021 年）的观察结果一致[54]
结论 界面吸附能力降低与界面压力降低直接相关，加强了蛋白质氧化态在调节乳液稳定性中的关键作用。
3.3.5 剪切扫描
Wang et al. （2023） [31]
同样记录了氧化诱导的结构柔韧性增强了蛋白质界面活性。这种现象与斯托克斯定律原理一致，该定律规定高粘度连续相会产生较高的流体动力阻力。这些力有效地阻碍了液滴迁移和碰撞动力学，从而通过降低絮凝电位来稳定分散相。相比之下，低粘度介质在液滴碰撞过程中无法耗散足够的动能，导致快速聚集和乳液稳定性下降。由此产生的聚结事件破坏了界面膜的连续性，加速了相分离和沉降过程。
大豆蛋白乳液在氧化还原转化过程中的流变行为如图 9 所示。在增加剪切速率 （0.01–100 s⁻¹） 下，所有乳液都表现出明显的剪切稀化曲线，
表观粘度逐渐减小至残差值。这种非牛顿假塑性行为源于相互连接的脂肪球簇的结构转变。具体来说，液滴周围的界面蛋白膜在剪切应力下被破坏或碎裂，导致液滴沿流动方向排列。这种结构重组降低了液滴间碰撞频率并最大限度地减少了摩擦能量耗散，从而解释了观察到的粘度降低。达到稳态粘度的临界剪切速率对应于液滴簇完全重新定向为层状排列。
在临界剪切速率阈值（图 9）下，液滴的层状排列实现了稳态平衡[55]
，导致表观粘度稳定的平台区域。值得注意的是，氧化诱导的大豆蛋白结构进化决定了双相流变行为：在起始阶段
l 20 d（0–20 d），乳液表现出明显的剪切稀化特性，整体黏度系统性增加。这种上升趋势与蛋白质分子在氧化应激下的逐渐变性相关，这增强了疏水塌陷和界面吸附效率。相反，在 25–35 d 时，粘度系统地降低，剪切稀化幅度减弱。这种转变归因于过度氧化诱导的蛋白质结构重排。具体来说，蛋白质二级结构的部分展开（例如，β 折叠含量从 25% 增加到 38%）会导致疏水残基和带电结构域的暴露。这些结构修饰协同放大了油-水界面的空间位阻效应和静电排斥，从而增强了界面膜的机械完整性。增强的薄膜弹性使乳液能够承受更高的剪切应力而不会发生结构破坏，动态振荡测量中存储模量 （G'） 的降低和损耗角正切 （tan δ） 的增加证明了这一点。
此外，从第 3 章的粒径和激光共聚焦显微镜（CLSM）观察来看，被大豆蛋白氧化到一定程度的乳液液滴逐渐减少，分布趋于均匀，这也导致液滴之间的相互作用逐渐增强，导致乳液粘度增加。随着蛋白质继续氧化并形成聚集体，界面吸附能力降低，液滴尺寸增加并发生团聚，削弱了液滴之间的相互作用并形成不太稳定的界面层，导致乳液的粘度降低。Taherian 等人的研究。[56]
还表明，在储存过程中形成的蛋白质氧化聚集体会影响制备的乳液的稳定性，导致絮凝和表观粘度降低。Liu 等人 [57]
报道了乳液的粘度与其稳定性呈正相关。
4 总结
大豆残留物的氧化显着影响大豆蛋白的结构和功能特性，从而损害蛋白质乳液的稳定性。值得注意的是，这种氧化过程的特点是两个关键的生物标志物：酸值的显着升高，这是公认的脂质氧化指标，以及反映高级氧化蛋白产物 （AOPP） 形成的羰基含量显着增加。结构分析揭示了次生蛋白质构象的双相变化： α-helix 和 β-sheet 结构最初减小后增加，而 β-turn 和无规则线圈构型表现出相反的趋势。同时，色氨酸残基的内禀荧光发射最大值 （λmax） 显示红移后蓝移，表明连续构象重排和微环境修饰。此外，动态光散射测量表明双相粒度演变，在氧化过程中先发生聚集，随后解体。这些发现共同强调了氧化修饰和蛋白质结构重排之间的复杂相互作用，这最终决定了氧化大豆蛋白在食品系统中的功能行为。
这些指标的趋势表明，蛋白质的氧化在一定程度上会导致其结构变得疏松，疏水基团暴露，保水留油能力增强。蛋白质的持续氧化导致其结构再次变得紧凑，疏水基团被埋没，水和油的保留能力减弱。蛋白质乳液的粒径和乳化指数先减小后升高，激光共聚焦显微镜观察（CLSM）显示，乳液液滴形态经历了从大絮凝到细均匀再到大聚集的进化过程，证实了大豆蛋白在一定程度上的氧化可以增强乳液的稳定性， 而蛋白质的持续氧化导致乳液稳定性变差。综上所述，大豆蛋白的氧化对其乳化和界面吸附性能有重要影响，为后续大豆蛋白的研究提供了一定的参考。
