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前扣带回皮层至基底外侧杏仁核回路活动增强介导与慢性疼痛相关的共病焦虑样行为

高峰 1 , 2 1 , 2 ^(1,2){ }^{1,2} 黄杰 1 1 ^(1){ }^{1} 黄国斌 1 1 ^(1){ }^{1} 尤强龙 1 1 ^(1){ }^{1} 姚山 1 1 ^(1){ }^{1} 赵申婷 3 3 ^(3){ }^{3} 刘健 1 1 ^(1){ }^{1} 吴翠红 1 1 ^(1){ }^{1} 陈贵福 1 1 ^(1){ }^{1} 刘仕敏 1 1 ^(1){ }^{1} 余宗延 1 1 ^(1){ }^{1} 周燕玲 4 4 ^(4){ }^{4} 宁玉平 4 4 ^(4){ }^{4} 刘神泉 5 5 ^(5){ }^{5} 胡冰洁 1 1 ^(1){ }^{1} 孙祥东 1 1 ^(1){ }^{1} 1 1 ^(1){ }^{1} 神经内科，神经科学研究所，广东省神经遗传与离子通道病重点实验室及教育部重点实验室，广州医科大学附属第二医院，基础医学院急诊科，中国广州 2 2 ^(2){ }^{2} 生理学系，基础医学院，广东医科大学，中国湛江 3 3 ^(3){ }^{3} 生理学系，基础医学院，广州医科大学，中国广州 4 4 ^(4){ }^{4} 精神科，广州医科大学附属医院，中国广州 5 5 ^(5){ }^{5} 数学学院，华南理工大学，中国广州

摘要

慢性疼痛可导致痛觉过敏和焦虑症状。然而，这两种成分在大脑中的编码方式仍不清楚。前扣带回皮层（PrL），作为痛觉和情绪调节的关键脑区，是对比这两种成分编码的理想介质。我们报告称，在慢性疼痛期间，投射到基底杏仁核（PrL BLA BLA  ^("BLA "){ }^{\text {BLA }} ）的 PrL 神经元和投射到腹侧被盖灰质（PrL 1 / v I P A C 1 / v I P A C ^(1//vIPAC){ }^{1 / v I P A C} ）的 PrL 神经元被分离，并分别表现出升高的和降低的神经元活动。一致地，光遗传学抑制 PrL-BLA 回路逆转了焦虑样行为，而激活 PrL-I/vIPAG 回路减轻了慢性疼痛小鼠的痛觉过敏。此外，机制研究表明，PrL 中升高的 TNF- α / α / alpha//\boldsymbol{\alpha} / TNFR1 信号导致 GluA1 受体插入 PrL BLA BLA  ^("BLA "){ }^{\text {BLA }} 神经元增加，并促进了慢性疼痛小鼠的焦虑样行为。总的来说，这些结果为 PrL 中控制疼痛相关痛觉过敏和焦虑样行为的回路和分子机制提供了见解。

引言

慢性疼痛是一种使人衰弱的疾病，影响着世界上超过 30 % 30 % 30%30 \% 的人口（1）。慢性疼痛难以治疗的一个潜在原因是，慢性疼痛患者经常感知到深刻的负面情绪变化，如焦虑，这反过来又会加剧感觉疼痛症状（2）。为了开发有效的治疗策略，减轻慢性疼痛患者的痛苦，深入了解导致疼痛超敏和共病焦虑的神经回路和分子机制至关重要。
疼痛是一种涉及感觉、动机和情感成分的不愉快体验（3）。伤害性信息通过外周感觉神经系统传递到高级脑区进行疼痛感知，同时与情感通路相互作用，这些通路的病理性激活与疼痛慢性期时的情绪功能障碍有关（4）。越来越多的证据表明，内侧前额叶皮层（mPFC），作为感觉和情绪过程自上而下控制的 crucial 区域，在调节疼痛中起着基本作用
慢性疼痛中的超敏反应和情绪缺陷（5, 6）。例如，初级前扣带回皮层（PrL）的神经元活动，作为前扣带回皮层（mPFC）的主要组成部分，在神经病理性疼痛和炎症性疼痛动物模型中均被报道减少（7-9）。激活所有 PrL 神经元或投射到腹侧被盖区（vlPAG）的特定神经元群体，可改善慢性疼痛小鼠的痛觉过敏表型（9-12）。这些观察结果表明，PrL 神经元活动的减弱会导致慢性疼痛期间痛觉处理增强。相反，大量证据表明，在高度焦虑状态下 PrL 会变得过度活跃（13）。PrL 神经元的药理学激活和抑制分别可诱导焦虑增强和焦虑缓解效应（14-16）。已知前扣带回皮层的投射神经元向基底外侧杏仁核（BLA）发送大量输出，而 BLA 是情绪控制的关键区域（17, 18）。 一项最新研究报道了 mPFC-BLA 回路活动增强以及由此引发的慢性抗性应激所致的焦虑样行为（19），这表明 mPFC-BLA 回路在介导负面情绪行为中起着关键作用。考虑到慢性疼痛期间超敏反应和焦虑症状的共病性，PrL 神经元活动中的这些看似不一致的观察结果表明，PrL 神经元的回路特异性功能障碍可能在慢性疼痛下分别影响超敏反应和焦虑症状。然而，慢性疼痛下 PrL 回路特异性变化的发生方式及其潜在的分子机制仍有待阐明。
采用病毒示踪、体内双光子（2P）钙成像、光遗传学、电生理学和行为学方法，
我们证明了在慢性疼痛小鼠模型中，PrL（前扣带回皮层）中的两种不同神经元群体分别投射到 l/vlPAG 和 BLA，分别调节超敏痛觉和焦虑样行为。随后的机制实验表明，增加的 TNF-α信号导致 GluA1 受体后突触表达的上调，从而增强支配 BLA 的 PrL 锥体神经元（PrL BLA BLA  ^("BLA "){ }^{\text {BLA }} ）的神经元活动。总的来说，我们的研究为我们认为的揭示慢性疼痛中超敏痛觉和焦虑共病的电路和分子机制提供了有力的证据。

结果

周围神经损伤会在前扣带回皮层（PrL）中引发时间依赖性和投射特异性的神经元活动变化。为了识别投射到基底杏仁核（BLA）（PrL BLA BLA ^(BLA){ }^{\mathrm{BLA}} ）和腹侧被盖区（vlPAG）（PrL 1 / 1 / 1//1 / ）的 PrL 中的兴奋性神经元（PrL 1 / IVPAG 1 /  IVPAG  ^(1//" IVPAG "){ }^{1 / \text { IVPAG }} ），我们将携带 eGFP 或 mCherry 的逆转录腺相关病毒载体（AAV2/Rs）分别注射到 BLA 和 l/vlPAG 中（图 1A 和补充图 1，A-D；补充材料可在本文在线获取；https://doi.org/10.1172/JCI166356DS1）。3 周后，我们比较了 PrL 中 PrL BLA BLA  ^("BLA "){ }^{\text {BLA }} 和 PrL 1 / IVPAG PrL 1 /  IVPAG  PrL^(1//" IVPAG ")\operatorname{PrL}^{1 / \text { IVPAG }} 神经元的分布。大多数 PrL BLA BLA  ^("BLA "){ }^{\text {BLA }} 和 PrL 1 / IVPAG PrL 1 /  IVPAG  PrL^(1//" IVPAG ")\operatorname{PrL}^{1 / \text { IVPAG }} 神经元与 CaMKII α α alpha\alpha 抗体共染色（补充图 1，E-G），证实了它们是兴奋性神经元。有趣的是，这些投射特异性神经元几乎没有共定位（图 1B）。值得注意的是，大约 93 % 93 % 93%93 \% 的 PrL 1 / IVPAG PrL 1 /  IVPAG  PrL^(1//" IVPAG ")\operatorname{PrL}^{1 / \text { IVPAG }} 兴奋性神经元局限于 PrL 的层 5，其中 3.6 % 3.6 % 3.6%3.6 \% 位于层 2 / 3 2 / 3 2//32 / 3 。相比之下，只有 26.4 % 26.4 % 26.4%26.4 \% 的 PrL BLA BLA  ^("BLA "){ }^{\text {BLA }} 兴奋性神经元位于层 5，其中 60.2 % 60.2 % 60.2%60.2 \% 位于层 2 / 3 2 / 3 2//32 / 3 （图 1C）。 这些观察结果与先前报告 ( 6 , 10 ( 6 , 10 (6,10(6,10 、12、20-23)一致，并表明 PrL BLA PrL BLA  PrL^("BLA ")\operatorname{PrL}^{\text {BLA }} 和 PrL 1 / /IPAG PrL 1 /  /IPAG  PrL^(1//" /IPAG ")\operatorname{PrL}^{1 / \text { /IPAG }} 兴奋性神经元表现出层特异性且非重叠的分布模式。
为了阐明慢性疼痛对这些特定投射神经元在 PrL 中的活动的影响，我们使用了一种神经病理性疼痛的小鼠模型，其中通过保留神经损伤（SNI）（24, 25）（图 1D）诱导慢性疼痛。SNI 小鼠表现出明显的痛觉过敏症状，因为手术后的疼痛感知机械阈值急剧降低（图 1E）。虽然这些小鼠在开放场测试（OFT）中行走的距离相似（补充图 1H），但与假手术对照组相比，它们在术后 2 周而不是 1 周时在场地中央区域停留的时间更短（图 1，F 和 G）。此外，与假手术对照组相比，在提升十字迷宫测试（EPM）中，术后 2 周而不是 1 周时，开放臂中的时间和进入开放臂的概率减少（图 1，H 和 I 和补充图 1I）。这些结果表明，在疼痛慢性过程中，焦虑样行为具有时间依赖性发展。然后，我们进行了体内 2 P Ca 2 + 2 P Ca 2 + 2PCa^(2+)2 \mathrm{P} \mathrm{Ca}^{2+} 成像，以纵向监测手术后在头部固定的清醒小鼠中这些神经元的实时活动（图 1J）。 一个携带基因编码的指示剂 GCaMP6s 的逆行性 AAV 被注射到 BLA 或 l/vlPAG 区域，并在对侧半球植入一个直角微型棱镜以实现同侧 PrL 区域的 Ca 2 + Ca 2 + Ca^(2+)\mathrm{Ca}^{2+} 成像（补充图 2，A-D）。3 周后记录了 PrL BLA PrL BLA PrL^(BLA)\mathrm{PrL}^{\mathrm{BLA}} 或 PrL 1 / /IPAG PrL 1 /  /IPAG  PrL^(1//" /IPAG ")\mathrm{PrL}^{1 / \text { /IPAG }} 神经元的自发 Ca 2 + Ca 2 + Ca^(2+)\mathrm{Ca}^{2+} 瞬态。我们发现，在假手术小鼠的 PrL BLA BLA  ^("BLA "){ }^{\text {BLA }} 或 PrL 1 / /lPAG 1 /  /lPAG  ^(1//" /lPAG ")^{1 / \text { /lPAG }} 神经元中，不同时间点的整合体细胞 Ca 2 + Ca 2 + Ca^(2+)\mathrm{Ca}^{2+} 活性或 Ca 2 + Ca 2 + Ca^(2+)\mathrm{Ca}^{2+} 瞬态的峰值幅度均未改变
术后（补充图 2，E-H 和补充视频 1 和 2），表明 Ca 2 + Ca 2 + Ca^(2+)\mathrm{Ca}^{2+} 活动随时间保持稳定。相比之下，在 SNI 小鼠术后 2 周，PrL BLA BLA  ^("BLA "){ }^{\text {BLA }} 神经元中的这两个参数均增加，尽管术后 1 周没有差异（图 1，K-M 和补充视频 3）。不同地，在 SNI 小鼠术后 1 周和 2 周， PrL 1 / /IPAG PrL 1 /  /IPAG  PrL^(1//" /IPAG ")\mathrm{PrL}^{1 / \text { /IPAG }} 神经元中的整合体细胞 Ca 2 + Ca 2 + Ca^(2+)\mathrm{Ca}^{2+} 活动以及 Ca 2 + Ca 2 + Ca^(2+)\mathrm{Ca}^{2+} 瞬态的峰值幅度均减少（图 1， N − P N − P N-P\mathrm{N}-\mathrm{P} 和补充视频 4）。总而言之，这些数据表明在慢性疼痛中，PrL 神经元活动存在时间依赖性和投射特异性变化。
光遗传学操作 PrL-BLA 回路可调节慢性疼痛小鼠的焦虑样行为，但不会加剧其痛觉过敏。为探究特定投射回路在慢性疼痛模型中的作用，我们尝试使用光遗传学操控单个回路，并检测疼痛阈值和焦虑样行为（图 2A）。我们首先利用光遗传学靶向 PrL-BLA 回路。在 CaMKII α α alpha\alpha 启动子控制下，将 Channelrhodopsin-2 (ChR2) 通过病毒在 PrL 中表达（补充图 3A）。脑片电流钳分析显示，在蓝色激光脉冲刺激下，ChR2 表达 PrL 神经元能可靠地诱导时间锁定的动作电位（补充图 3，B-D）。此外，刺激 BLA 中的 ChR2 阳性纤维可诱发 BLA 神经元中的短潜伏期兴奋性突触后电流（eEPSCs）（补充图 3，E-H）。eEPSCs 可被河豚毒素（TTX）阻断，并通过进一步处理钾通道阻断剂 4-氨基吡啶（4-AP）得到恢复（补充图 3，G 和 H）。 这些观察结果表明，PrL 兴奋性神经元与 BLA 神经元之间存在单突触连接，这与之前的报告 ( 19 , 26 ) ( 19 , 26 ) (19,26)(19,26) 一致。
为检验 PrL-BLA 回路激活是否可促进慢性痛小鼠的焦虑样行为，我们将表达 ChR2 的病毒载体注射到 PrL 区，并将光学灌流管植入 BLA 区（图 2B）。通过蓝光照射激活 PrL-BLA 回路，并在 SNI 手术 1 周后（此时小鼠尚未表现出焦虑样表型）检测其痛阈和焦虑样行为。我们发现蓝光刺激对痛阈影响甚微，提示 PrL-BLA 回路在痛觉感知中作用不大（图 2C）。然而，蓝光刺激减少了表达 ChR2 的 SNI 小鼠（SNI+ChR2）在 OFT 中心区的停留时间和在 EPM 开放臂的停留时间，而表达 ChR2 的假手术小鼠（Sham+ChR2）、表达 mCherry 的假手术小鼠（Sham+mCherry）或表达 mCherry 的 SNI 小鼠（SNI+mCherry）的这些参数未发生改变（图 2，D 和 E）。这些结果表明，PrL-BLA 回路激活可促进焦虑样行为，但对痛觉感知影响甚微。
为探究抑制 PrL-BLA 回路是否能逆转慢性疼痛小鼠的焦虑症状，我们将表达卤素视蛋白（NpHR 表达）的病毒载体注射到 PrL（补充图 4A）。持续的黄光照射可靠地抑制了 PrL 锥体神经元放电（补充图 4，B 和 C）。此外，在 BLA 中对 PrL 传入末梢进行光抑制降低了自发性兴奋性突触后电流（sEPSCs）的频率但未改变其幅度，对自发性抑制性突触后电流（sIPSCs）影响较小（补充图 4，D-N）。这些观察结果表明 PrL-BLA 回路被成功抑制。
图 1. 外周神经损伤导致 PrL 神经元活动出现时间依赖性和投射特异性变化。(A)病毒注射示意图。(B)PrL 中 eGFP 和 mCherry 的表达。左，包含 PrL 区域的半脑切片；中，左图中标记区域的放大，顺时针旋转 90 ∘ 90 ∘ 90^(@)90^{\circ} ；右，PrL 不同层中绿色（PrL BLA BLA  ^("BLA "){ }^{\text {BLA }} ）和红色（PrL 1/vIPAC 1/vIPAC  ^("1/vIPAC "){ }^{\text {1/vIPAC }} ）荧光强度分布。a.u.，任意单位。标尺： 600 μ m 600 μ m 600 mum600 \mu \mathrm{~m} （左）和 100 μ m 100 μ m 100 mum100 \mu \mathrm{~m} （中）。© PrL BLA BLA  ^("BLA "){ }^{\text {BLA }} 和 PrL I/vPAG I/vPAG  ^("I/vPAG "){ }^{\text {I/vPAG }} 神经元的比例。 n = 20 n = 20 n=20n=20 切片来自 5 只小鼠。(D)SNI 手术示意图。(E)SNI 小鼠机械痛阈降低。 n = 10 n = 10 n=10n=10 只小鼠每组。 ( F F F\mathbf{F} 和 H H H\mathbf{H} ) OFT（ F F F\mathbf{F} ）和 EPM（H）中小鼠移动的代表性轨迹。( C C C\mathbf{C} ) SNI 小鼠在中心区域停留时间减少。 n = 8 n = 8 n=8n=8 只小鼠每组。(I) SNI 小鼠在开放臂停留时间减少。 n = 8 n = 8 n=8n=8 只小鼠每组。(J)清醒小鼠体内 2P Ca 2 + 2 + ^(2+){ }^{2+} 成像的时间方案。(K) SNI 小鼠 PrL BLA BLA  ^("BLA "){ }^{\text {BLA }} 神经元的代表性胞体荧光图像，在基线（BL）、1 周（1 W）和 2 周（2 W）时拍摄。 底部， Ca 2 + Ca 2 + Ca^(2+)\mathrm{Ca}^{2+} 标记的神经元（C1、C2、C3）的荧光轨迹，这些神经元在上方图像中被圈出。标尺： 10 μ m 10 μ m 10 mum10 \mu \mathrm{~m} （上方）， 500 % Δ F / F 500 % Δ F / F 500%Delta F//F500 \% \Delta F / F 和 20 秒（下方）。（ L L L\mathbf{L} 和 M M M\mathbf{M} ）SNI 小鼠中 PrL 神经元的整合体素 Ca 2 + Ca 2 + Ca^(2+)\mathrm{Ca}^{2+} 活性（ L L L\mathbf{L} ）和峰值幅度（ M M M\mathbf{M} ）增加。来自 6 只小鼠的 n = 131 n = 131 n=131n=131 神经元。（N）PrL 神经元的代表性体素 Ca 2 + Ca 2 + Ca^(2+)\mathrm{Ca}^{2+} 荧光图像。底部， Ca 2 + Ca 2 + Ca^(2+)\mathrm{Ca}^{2+} 标记的神经元（C1、C2、C3）的荧光轨迹，这些神经元在上方图像中被圈出。标尺： 10 μ m 10 μ m 10 mum10 \mu \mathrm{~m} （上方）， 500 % Δ F / F 500 % Δ F / F 500%Delta F//F500 \% \Delta F / F 和 20 秒（下方）。（ 0 0 0\mathbf{0} 和 P P P\mathbf{P} ）SNI 小鼠中 PrL 神经元的整合体素 Ca 2 + Ca 2 + Ca^(2+)\mathrm{Ca}^{2+} 活性（ 0 0 0\mathbf{0} ）和峰值幅度 § 的减少。来自 5 只小鼠的 n = 104 n = 104 n=104n=104 神经元。数据以平均 ± ± +-\pm 标准误或对齐点图表示。 ∗ P < 0.05 ∗ P < 0.05 ^(**)P < 0.05{ }^{*} P<0.05 、 ∗ ∗ P < 0.01 ∗ ∗ P < 0.01 ^(****)P < 0.01{ }^{* *} P<0.01 、 ∗ ∗ ∗ P < 0.001 ∗ ∗ ∗ P < 0.001 ^(******)P < 0.001{ }^{* * *} P<0.001 。 2 方向重复测量方差分析后进行事后 Šidák 检验（E、G 和 I）；Friedman 检验后进行事后 Dunn 检验（L、M、O 和 P）。
黄色光。值得注意的是，对 PrL-BLA 回路的的光抑制对疼痛阈值几乎没有影响，但在表达 NpHR 的 SNI 小鼠的 OFT 中增加了在中心的时间，以及在 EPM 中增加了在开放臂的时间，而不是在表达 mCherry 的控制小鼠或 2 周时有无 NpHR 表达的假手术小鼠。
术后（图 2，F-I）。这些结果共同表明，PrL-BLA 回路在调节慢性疼痛小鼠的焦虑样行为中起着关键作用，但在导致痛觉过敏方面没有作用。这一观点得到了以下结果的加强：一部分来自假手术组和 SNI 组的小鼠神经元表现出增加的 Ca 2 + Ca 2 + Ca^(2+)\mathrm{Ca}^{2+} 活动。
  1. 作者贡献说明：FG、JH、GBH 和 QLY 对这项工作贡献相同。
    利益冲突：作者声明不存在利益冲突。
    版权：© 2023，高等人。本文在知识共享署名4.0国际许可协议下开放获取出版。
    提交日期：2022年10月18日；接受日期：2023年3月8日；发表日期：2023年5月1日。
    参考文献信息：/ 临床研究。2023；133(9)：e166356。
    https://doi.org/10.1172/JCl166356。