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ROYAL SOCIETY
OF CHEMISTRY OF CHEMISTRY
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一锅式等温 CRISPR/Dx 系统用于微 RNA 的特异性和高灵敏度检测

收到日期：20xx 年 1 月 00 日，
接受日期：20xx 年 1 月 1 日
DOI： 10.1039 / x 0 x x 00000 x 10.1039 / x 0 x x 00000 x 10.1039//x0xx 00000 x10.1039 / x 0 x x 00000 x

李新宇 a，b\＃ a，b\＃ ^("a，b\＃"){ }^{\text {a，b\＃}}，＃ ，黄志豪 c\＃ c\＃ ^("c\＃"){ }^{\text {c\＃}}＃ ，刘家欣 c\＃ c\＃ ^("c\＃"){ }^{\text {c\＃}}＃ ，李家琪\＃，邹明海 c c  ^("c "){ }^{\text {c }} ，吴卫东 c c  ^("c "){ }^{\text {c }} ，陈晓青 c c  ^("c "){ }^{\text {c }} ，李家辉，黄玉梅，王涛 c c ^(c){ }^{c} ，李玉林，徐美静 d d ^(d){ }^{d} ，黄晓军 d d ^(d){ }^{d} ，朱海宝 c , e ∗ c , e ∗ ^(c,e**){ }^{c, e *} ，杨春康 f , g ∗ f , g ∗ ^(f,g**){ }^{\mathrm{f}, \mathrm{g} *}

  摘要

微小 RNA（miRNA）是胰腺癌早期诊断的潜在生物标志物。为了实现对 miRNA 的敏感和可靠检测，我们开发了一种一管式等温 CRISPR/Dx 检测系统，该系统通过结合滚环放大（RCA）与 CRISPR/Cas12a 技术实现。RCA 与 CRISPR/Cas12a 反应在单一封闭管内完成，省去了样本转移步骤。我们证明了该一管式 CRISPR/Dx 系统检测胰腺癌的可行性，靶标为 miR-25、miR-191、miR-205 和 miR-1246。当应用于荧光和侧流条带纸基检测平台时，我们的单管 CRISPR/Dx 系统分别以 6.60 fM 和 500 fM 的检测限（LOD）检测到合成 miR-25。该系统具有高度靶向特异性，能够区分单碱基突变的 miR-25 及高度同源的 miRNA 种类。此外，该系统成功推广至检测其他与胰腺癌相关的 miRNA，包括 miR-191、miR-205 和 miR-1246。重要的是，我们的单管 CRISPR/Dx 系统能够特异性、高灵敏度地检测人胰腺癌细胞系 PANC-1 中的内源性 miR-25。我们成功开发了一种一锅式等温 CRISPR/Dx 系统，可实现对 miRNA 的高特异性和高灵敏度检测。该系统具有高度灵活性和经济性，因同一 crRNA 可检测不同 miRNA，仅需对锁定探针进行少量修改。因此，该技术有望转化为临床应用及 POCT，用于多种人类癌症的诊断。

  引言

胰腺癌是致死率极高的癌症之一，主要由于其高度侵袭性和快速进展。 1 , 2 1 , 2 ^(1,2){ }^{1,2} 由于胰腺在常规医学检查中难以检查，胰腺癌常在转移阶段被发现，且早期通常无明显症状。当胰腺癌进展至晚期时，该致命疾病的治疗难度极高。临床上，胰腺癌通过影像学检查（如 MRI 或 CT 扫描）进行诊断，随后通过活检确认。 3 3 ^(3){ }^{3} 血液检测可用于胰腺癌筛查，但目前可靠且敏感的血液标志物尚不充足。其中，微小 RNA（miRNA）是胰腺癌早期诊断中具有潜力的血液标志物。 4 , 5 4 , 5 ^(4,5){ }^{4,5} 成熟的 miRNA 是一种小分子、单链、高度保守的非编码 RNA 分子，参与基因表达的调控． 6 , 7 6 , 7 ^(6,7){ }^{6,7}
微小 RNA（miRNA）的调控异常与癌症进展、转移、治疗反应及患者生存率密切相关。 8 − 8 − ^(8-){ }^{8-} 10 10 ^(10){ }^{10} 循环中 miRNA 最近被提出作为胰腺癌潜在诊断标志物。 5 5 ^(5){ }^{5}
miRNA 的检测是一项具有挑战性的任务，主要原因在于其分子量小、丰度低以及同源家族成员之间序列高度保守。 11 11 ^(11){ }^{11} 传统上，miRNA 检测技术主要基于 Northern 印迹、微阵列分析和定量聚合酶链反应（qPCR）。 11 11 ^(11){ }^{11} Northern 印迹检测灵敏度低，实验流程复杂且耗时，且需要大量 RNA 样本。 12 , 13 12 , 13 ^(12,13){ }^{12,13} 微阵列分析检测灵敏度低，且杂交时间较长． 14 , 15 14 , 15 ^(14,15){ }^{14,15} 尽管基于 qPCR 的方法具有高检测灵敏度的优势，但模板的非特异性扩增和序列偏好性扩增可能导致误导性结果． 16 , 17 16 , 17 ^(16,17){ }^{16,17} 该方法需要纯化的核酸，精确的温度控制，以及体积庞大且复杂的热循环仪器。这使得其在资源有限和床边检测环境中的应用受到限制。
近年来，为解决上述问题，研究人员开发了多种电化学平台 18 − 21 18 − 21 ^(18-21){ }^{18-21} 和信号放大技术 22 − 24 22 − 24 ^(22-24){ }^{22-24} 用于检测 miRNA。尽管这些方法实现了高检测灵敏度和优异的选择性，但由于操作流程不标准化且复杂、检测成本高昂，以及样本预处理或信号读出需要复杂且笨重的设备，这些方法在不同领域尚未获得广泛应用和认可。等温扩增技术，如滚环扩增（RCA），可作为解决这些问题的替代方案。RCA 利用环状探针作为模板，在短核酸引物的启动下生成长串联单链 DNA。 25 , 26 25 , 26 ^(25,26){ }^{25,26}
为了提高 RCA 的检测灵敏度，研究人员利用 CRISPR/Cas12a 的转切裂解活性来检测 RCA 扩增子。 27 − 33 27 − 33 ^(27-33){ }^{27-33} CRISPR/Cas12a 复合体作为一种 RNA 引导的内切核酸酶，通过 Cas12a 介导的 DNA 切割和 crRNA 引导的目标序列识别发挥功能。 34 34 ^(34){ }^{34} CRISPR/Cas12a 识别含有 5’端 T 富集原原间序列（PAM）的靶双链 DNA（TTTN 或 TTTV）。CRISPR/Cas12a 对单链 DNA（ssDNA）具有顺式和反式切割活性。活性 Cas12 对非靶标 ssDNA（如荧光报告探针）的旁路切割会导致信号放大，从而实现检测。 35 35 ^(35){ }^{35} 与 RCA 类似，该方法在恒定低温下使用微型设备运行，从而实现便携式和床边检测（POCT）。将 RCA 与 CRISPR/Cas12a 结合，可实现对 miRNA 的超灵敏和超特异性检测，这得益于其双信号放大及双识别要求。 27 − 33 27 − 33 ^(27-33){ }^{27-33} RCA-CRISPR/Cas12a 混合系统还支持可视化读出和便携式诊断。然而，RCA 和 CRISPR/Cas12a 反应通常采用两步协议进行，其中 RCA 扩增产物需转移至另一管中进行 CRISPR/Cas12a 反应。 29 , 36 29 , 36 ^(29,36){ }^{29,36} 该两步协议存在气溶胶污染风险及操作复杂性。
为了使 RCA 和 CRISPR/Cas12a 能在单一反应管中完成，从而省去转移步骤，我们在本研究中提出了一种一锅式等温 CRISPR/Dx 系统。在此，我们尝试将 RCA 和 CRISPR/Cas12a 混合物合并到单一反应管中，以检测 miRNA。作为原理验证，我们通过靶向 miR-25、miR-191、miR-205 和 miR-1246，证明了一体化 CRISPR/Dx 系统在检测胰腺癌中的可行性。我们的 CRISPR/Dx 系统被应用于荧光检测和侧流条带纸基检测平台。

  材料与方法

细胞培养与微小 RNA 提取

PANC-1 和 BEAS-2B 细胞在含 10% 胎牛血清（Gibco）的 Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基（高葡萄糖，Gibco）中培养。细胞在标准细胞培养条件下（ 37 ∘ C , 5 % CO 2 37 ∘ C , 5 % CO 2 37^(@)C,5%CO_(2)37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} ）于恒湿培养箱中培养。人微 RNA 从培养细胞中提取，使用 Cook Gene（武汉，中国）购买的人微 RNA 提取试剂盒。提取的微 RNA 浓度使用 Nanodrop One 测定。

滚动圆形放大（RCA）

RCA 反应试剂购自 New England Biolabs。简要说明，RCA 反应混合液由以下组分组成： 10.3 μ L 10.3 μ L 10.3 muL10.3 \mu \mathrm{~L} 无 RNA 酶水， 2 μ L 2 μ L 2muL2 \mu \mathrm{~L} 1 × 1 × 1xx1 \times SplintR 连接酶反应缓冲液， 1 μ L 1 μ L 1muL1 \mu \mathrm{~L} 10 μ M 10 μ M 10 muM10 \mu \mathrm{M} 锁定探针， 1 μ L 1 μ L 1muL1 \mu \mathrm{~L} dNTP， 0.5 μ L 0.5 μ L 0.5 muL0.5 \mu \mathrm{~L} 重组白蛋白 RBA， 1 μ L 1 μ L 1muL1 \mu \mathrm{~L} SplintR 连接酶，以及 0.2 μ L 0.2 μ L 0.2 muL0.2 \mu \mathrm{~L} Phi 29 DNA 聚合酶。 2 μ L 2 μ L 2muL2 \mu \mathrm{~L} 的微 RNA 样本和 2 μ L 2 μ L 2muL2 \mu \mathrm{~L} 的 10× SYBR Green II 凝胶染料随后加入到 RCA 混合液中。总反应体积为 20 μ L 20 μ L 20 muL20 \mu \mathrm{~L} 。RCA 在 37 ∘ C 37 ∘ C 37^(@)C37^{\circ} \mathrm{C} 下进行 2 小时，随后在 65 ∘ C 65 ∘ C 65^(@)C65^{\circ} \mathrm{C} 下终止反应 10 分钟。生成的荧光信号（激发波长 = 470 nm = 470 nm =470nm=470 \mathrm{~nm} ，发射波长 = 525 nm = 525 nm =525nm=525 \mathrm{~nm} ）通过实时荧光定量 PCR 仪（bioer, FQD96A）检测。RCA 产物通过 1.5 % 1.5 % 1.5%1.5 \% 琼脂糖凝胶电泳（120 V，30 分钟）进行验证。DNA 条带由凝胶成像仪（P&Q，JS-2012）捕获。所有引物序列见表 1。

基于荧光的 CRISPR/Cas12a 系统检测

DOI. 10 文章在线 DOI: 10.1039/D4AY01695E CRISPR RGEN 工具 Cas-Designer, 37 37 ^(37){ }^{37} 用于识别 crRNA 的靶序列（表 2）。寡核苷酸的设计基于靶位点序列（21 bp）。所选 crRNA 靶序列在 2 核苷酸不匹配范围内不存在 RNA 引导内切核酸酶的潜在脱靶位点。crRNA 由 Jima Gene（上海，中国）合成并购置。
总反应体积为 20 μ L 20 μ L 20 muL20 \mu \mathrm{~L} 。除非另有说明，CRISPR/Cas12a 系统由 5.15 μ L 5.15 μ L 5.15 muL5.15 \mu \mathrm{~L} 的无核糖核酸酶水、 1 μ L 1 μ L 1muL1 \mu \mathrm{~L} L10x SplitR 连接酶反应缓冲液， 0.25 μ L 0.25 μ L 0.25 muL0.25 \mu \mathrm{~L} 40 U / μ L 40 U / μ L 40U//muL40 \mathrm{U} / \mu \mathrm{L} Ribolock RNase 抑制剂， 0.4 μ L 0.4 μ L 0.4 muL0.4 \mu \mathrm{~L} 1 μ M 1 μ M 1muM1 \mu \mathrm{M} crRNA，以及 0.2 μ L 0.2 μ L 0.2 muL0.2 \mu \mathrm{~L} LbCas12a 酶。CRISPR/Cas12a 反应混合物在室温下孵育 15 分钟，以使 crRNA 和 LbCas12a 组装成 RNP 复合物。随后向 RNP 复合物中加入 1 μ L 1 μ L 1muL1 \mu \mathrm{~L} 的 20 μ M 20 μ M 20 muM20 \mu \mathrm{M} 报告探针 AT，再加入 2 μ L 2 μ L 2muL2 \mu \mathrm{~L} 的合成微 RNA。在对照组中，用无核糖核酸酶水替换合成微 RNA。CRISPR/Cas12a 反应在 37 ∘ C 37 ∘ C 37^(@)C37{ }^{\circ} \mathrm{C} 条件下进行 1 小时。生成的荧光信号（激发波长=470nm，发射波长 = 525 nm = 525 nm =525nm=525 \mathrm{~nm} ）通过实时荧光定量 PCR 仪（bioer, FQD-96A）检测。

一锅法 CRISPR/Dx 系统用于 RCA 和 CRISPR/Cas12a

首先，CRISPR/Cas12a 反应混合液由以下成分组成： 8 μ L 8 μ L 8muL8 \mu \mathrm{~L} 无核糖核酸酶（RNase）水， 2 μ L 2 μ L 2muL2 \mu \mathrm{~L} 10×SplintR 连接酶反应缓冲液， 0.25 μ L 0.25 μ L 0.25 muL0.25 \mu \mathrm{~L} 40 U / μ L 40 U / μ L 40U//muL40 \mathrm{U} / \mu \mathrm{L} Ribolock 核糖核酸酶抑制剂， 1 μ L 1 μ L 1muL1 \mu \mathrm{~L} 的 1 μ M 1 μ M 1muM1 \mu \mathrm{M} crRNA，以及 0.5 μ L 0.5 μ L 0.5 muL0.5 \mu \mathrm{~L} 的 1 μ M 1 μ M 1muM1 \mu \mathrm{M} LbCas12a 酶混合后，于室温下孵育 15 分钟以形成 RNP 复合物。然后， 1.25 μ L 1.25 μ L 1.25 muL1.25 \mu \mathrm{~L} 份 40 μ M 40 μ M 40 muM40 \mu \mathrm{M} 报告探针 AT， 1.25 μ L 1.25 μ L 1.25 muL1.25 \mu \mathrm{~L} 份 10 μ M 10 μ M 10 muM10 \mu \mathrm{M} 锁定垫锁探针， 0.8 μ L 0.8 μ L 0.8 muL0.8 \mu \mathrm{~L} 份 dNTP， 0.5 μ L 0.5 μ L 0.5 muL0.5 \mu \mathrm{~L} 份重组白蛋白 RBA， 1.25 μ L 1.25 μ L 1.25 muL1.25 \mu \mathrm{~L} SplitR 连接酶，以及 0.25 μ L 0.25 μ L 0.25 muL0.25 \mu \mathrm{~L} Phi29 DNA 聚合酶加入到 CRISPR/Cas12a 混合物中。加入无 RNA 酶水，使总反应体积达到 23 μ L 23 μ L 23 muL23 \mu \mathrm{~L} 。最后，加入 2 μ L 2 μ L 2muL2 \mu \mathrm{~L} 微 RNA 样本到该混合物中。RCA 和 CRISPR/Cas12a 在 37 ∘ C 37 ∘ C 37^(@)C37^{\circ} \mathrm{C} 条件下反应 2 小时。生成的荧光信号（激发波长=470nm，发射波长 = 525 nm = 525 nm =525nm=525 \mathrm{~nm} ）通过实时荧光定量 PCR 仪器（bioer, FQD-96A）检测。

侧流免疫层析试纸条分析

RCA 和 CRISPR/Cas12a 反应混合物的制备与上述描述的一锅法 CRISPR/Dx 系统类似。唯一区别在于使用了不同的荧光报告探针。在此情况下，报告探针 3’端处的淬灭剂被修饰为生物素。在单锅 CRISPR/Dx 反应后，向所有 25 μ L 25 μ L 25 muL25 \mu \mathrm{~L} 反应产物中加入 75 μ L 75 μ L 75 muL75 \mu \mathrm{~L} 无 RNA 酶水。将稀释后的产物 50 μ L 50 μ L 50 muL50 \mu \mathrm{~L} 加入商业试纸条（Gendx Biotech）的加样区，孵育 10 分钟。随后观察侧流试纸条上红色条带的出现情况并拍照。

  茎环逆转录聚合酶链反应

提取的总 miRNA 使用 EasyScript 逆转录酶（TransGen Biotech）进行逆转录。逆转录反应包含以下组分： 3.75 μ L 3.75 μ L 3.75 muL3.75 \mu \mathrm{~L} 纯化的 miRNA， 5 μ L 5 μ L 5muL5 \mu \mathrm{~L} 的 2 × 2 × 2xx2 \times 逆转录反应混合液， 0.5 μ L 0.5 μ L 0.5 muL0.5 \mu \mathrm{~L} 的 0.1 μ M 0.1 μ M 0.1 muM0.1 \mu \mathrm{M} 茎环逆转录引物， 0.5 μ L 0.5 μ L 0.5 muL0.5 \mu \mathrm{~L} 的逆转录酶，以及 0.25 μ L 0.25 μ L 0.25 muL0.25 \mu \mathrm{~L} 的 40 U / μ l 40 U / μ l 40U//mul40 \mathrm{U} / \mu \mathrm{l} 核糖核酸酶抑制剂。 10 μ l 10 μ l 10 mul10 \mu \mathrm{l} 反应在 Bio-Rad T100 热循环仪中于 25 ∘ C , 15 min 25 ∘ C , 15 min 25^(@)C,15min25^{\circ} \mathrm{C}, 15 \mathrm{~min} 、 42 ∘ C , 1 min 42 ∘ C , 1 min 42^(@)C,1min42^{\circ} \mathrm{C}, 1 \mathrm{~min} 、 85 ∘ C 85 ∘ C 85^(@)C85^{\circ} \mathrm{C} 条件下孵育 10 分钟，随后保持在 4 ∘ C 4 ∘ C 4^(@)C4^{\circ} \mathrm{C} 。
实时聚合酶链反应（Real-time PCR）采用 qPCR Master Mix（General Biosystems Corp．Ltd．）进行。PCR 反应体系包含： 20 μ I 20 μ I 20 muI20 \mu \mathrm{I} RT 产物， 5 μ l 5 μ l 5mul5 \mu \mathrm{l} PCR Master Mix， 10 μ l 10 μ l 10 mul10 \mu \mathrm{l} 2 × 2 × 2xx2 \times PCR Master Mix， 0.5 μ L 0.5 μ L 0.5 muL0.5 \mu \mathrm{~L} 10 μ M 10 μ M 10 muM10 \mu \mathrm{M} 正向引物， 0.5 μ L 0.5 μ L 0.5 muL0.5 \mu \mathrm{~L} 10 μ M 10 μ M 10 muM10 \mu \mathrm{M} 反向引物， 1 μ L 1 μ L 1muL1 \mu \mathrm{~L} 10 μ M 10 μ M 10 muM10 \mu \mathrm{M} 探针，以及 3 μ L 3 μ L 3muL3 \mu \mathrm{~L} 无核酸酶水。反应在 LineGene 9600 Plus（BIOER TECHNOLOGY）中于 95 ∘ C 95 ∘ C 95^(@)C95^{\circ} \mathrm{C} 孵育 5 分钟，随后进行 40 个循环，每个循环包括 95 ∘ C 95 ∘ C 95^(@)C95^{\circ} \mathrm{C} 15 秒和 59 ∘ C 59 ∘ C 59^(@)C59^{\circ} \mathrm{C} 30 秒。所有反应均重复三次。

  数据分析

除非另有说明，数据以均值 ± 标准差的形式呈现。所有柱状图和曲线图均使用 Graphpad Prism 9.0 软件绘制。采用单因素方差分析（ANOVA）对组间差异进行统计学显著性比较。P 值小于 0.05 视为具有统计学意义。
表 1．本研究中使用的 DNA 寡核苷酸
  寡肽   目的   序列（5'－3'）
PP－CTA5－1 RCA 5'p-CAAGTGCAATGCACACATCAAAGCCCATACTACAACAACTA CAACATCAGACCGAGA
PP－CTA5－2 RCA 5'p-CAAGTGCAATGGTCAGCACACATCAAAGCCCATACTACAACAA CTACAACATCAGACCGAGA
PP－CTA5－3 RCA 5'p-CAAGTGCAATGGTCAGCACACATCAAAGCCCATCCCATCAAACATA CTACAACAACTACAACATCAGACCGAGA
PP－1246－CTA5 RCA 5'p-AAATCCATTGTCAGCACACATCAAAGCCCATCCCATCAAACATA CTACAACAACTACAACA CCTGCTCCAA
PP－205－5p－CTA5 RCA 5'p－GGAATGAAGGAGTCAGCACACATCAAAGCCCATCCCATCAAACATA CTACAACAACTACAACACAGACTCCGGT
PP－191－5p－CTA5 RCA 5'p－GGATTCCGTTGGTCAGCACACATCAAAGCCCATCCCATCAAACATA CTACAACAACTACAACACAGCTGCTTTTG
  92a－PP1－RCA－产品 RCA TCCCGGCCTGTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTCCCCTTCCCTATTGCACTTG
  92a－PP2－RCA－产品 RCA TCTCGGTCTGACCCTATAGTGAGTCGTATTAATTCCCCTTCCCCATTGCACTTG
  92a－PP3－RCA－产品 RCA TCCCGGCCTGTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTCCCCGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTATTGCACTTG
  25－CTA5－RCA－产品 RCA TCTCGGTCTGATGTTGTAGTTGTTGTAGTATGGGCTTTGATGTGTGCATTGCACTTG
25－CTA5－2－RCA－product RCA TCTCGGTCTGATGTTGTAGTTGTTGTAGTATGGGCTTTGATGTGTGCTGACCATTGCACTTG
  25－CTA5－3－RCA－产品 RCA TCTCGGTCTGATGTTGTAGTTGTTGTAGTATGTTTGATGGGATGGGCTTTGATGTGTGCTGACCATTGCACTTG
  记者调查 AT CRISPR／Cas12a   5'-FAM-TTATTATT-BHQ1-3'
  记者探针 AT-生物素 CRISPR／Cas12a 5＇－FAM－TTATTATT－Biotin－3＇
RT1．2－has－miR－25－3p   实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR） GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC TCAGACC
F1．2－has－miR－25－3p   实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）   GCG 嘌呤嘧啶嘧啶嘧啶嘧
  RP－miR－通用型   实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR） GTGCAGGGTCCGAGGT
P1－has－miR－25－3p   实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR） 6＇FAM－TGGATACGAC TCAGA－MGB
Table 1．DNA oligonucleotides used in this study Oligo name Purpose Sequence（5＇－3＇） PP－CTA5－1 RCA 5＇p－CAAGTGCAATGCACACATCAAAGCCCATACTACAACAACTA CAACATCAGACCGAGA PP－CTA5－2 RCA 5＇p－CAAGTGCAATGGTCAGCACACATCAAAGCCCATACTACAACAA CTACAACATCAGACCGAGA PP－CTA5－3 RCA 5＇p－CAAGTGCAATGGTCAGCACACATCAAAGCCCATCCCATCAAACATA CTACAACAACTACAACATCAGACCGAGA PP－1246－CTA5 RCA 5＇p－AAATCCATTGTCAGCACACATCAAAGCCCATCCCATCAAACATA CTACAACAACTACAACA CCTGCTCCAA PP－205－5p－CTA5 RCA 5＇p－GGAATGAAGGAGTCAGCACACATCAAAGCCCATCCCATCAAACATA CTACAACAACTACAACACAGACTCCGGT PP－191－5p－CTA5 RCA 5＇p－GGATTCCGTTGGTCAGCACACATCAAAGCCCATCCCATCAAACATA CTACAACAACTACAACACAGCTGCTTTTG 92a－PP1－RCA－product RCA TCCCGGCCTGTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTCCCCTTCCCTATTGCACTTG 92a－PP2－RCA－product RCA TCTCGGTCTGACCCTATAGTGAGTCGTATTAATTCCCCTTCCCCATTGCACTTG 92a－PP3－RCA－product RCA TCCCGGCCTGTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTCCCCGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTATTGCACTTG 25－CTA5－RCA－product RCA TCTCGGTCTGATGTTGTAGTTGTTGTAGTATGGGCTTTGATGTGTGCATTGCACTTG 25－CTA5－2－RCA－product RCA TCTCGGTCTGATGTTGTAGTTGTTGTAGTATGGGCTTTGATGTGTGCTGACCATTGCACTTG 25－CTA5－3－RCA－product RCA TCTCGGTCTGATGTTGTAGTTGTTGTAGTATGTTTGATGGGATGGGCTTTGATGTGTGCTGACCATTGCACTTG Reporter probe AT CRISPR／Cas12a 5＇－FAM－TTATTATT－BHQ1－3＇ Reporter probe AT－biotin CRISPR／Cas12a 5＇－FAM－TTATTATT－Biotin－3＇ RT1．2－has－miR－25－3p RT－qPCR GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC TCAGACC F1．2－has－miR－25－3p RT－qPCR GCG CATTGCACTTGTCTC RP－miR－universal RT－qPCR GTGCAGGGTCCGAGGT P1－has－miR－25－3p RT－qPCR 6＇FAM－TGGATACGAC TCAGA－MGB| Table 1．DNA oligonucleotides used in this study | | | | :--- | :--- | :--- | | Oligo name | Purpose | Sequence（5＇－3＇） | | PP－CTA5－1 | RCA | 5＇p－CAAGTGCAATGCACACATCAAAGCCCATACTACAACAACTA CAACATCAGACCGAGA | | PP－CTA5－2 | RCA | 5＇p－CAAGTGCAATGGTCAGCACACATCAAAGCCCATACTACAACAA CTACAACATCAGACCGAGA | | PP－CTA5－3 | RCA | 5＇p－CAAGTGCAATGGTCAGCACACATCAAAGCCCATCCCATCAAACATA CTACAACAACTACAACATCAGACCGAGA | | PP－1246－CTA5 | RCA | 5＇p－AAATCCATTGTCAGCACACATCAAAGCCCATCCCATCAAACATA CTACAACAACTACAACA CCTGCTCCAA | | PP－205－5p－CTA5 | RCA | 5＇p－GGAATGAAGGAGTCAGCACACATCAAAGCCCATCCCATCAAACATA CTACAACAACTACAACACAGACTCCGGT | | PP－191－5p－CTA5 | RCA | 5＇p－GGATTCCGTTGGTCAGCACACATCAAAGCCCATCCCATCAAACATA CTACAACAACTACAACACAGCTGCTTTTG | | 92a－PP1－RCA－product | RCA | TCCCGGCCTGTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTCCCCTTCCCTATTGCACTTG | | 92a－PP2－RCA－product | RCA | TCTCGGTCTGACCCTATAGTGAGTCGTATTAATTCCCCTTCCCCATTGCACTTG | | 92a－PP3－RCA－product | RCA | TCCCGGCCTGTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTCCCCGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTATTGCACTTG | | 25－CTA5－RCA－product | RCA | TCTCGGTCTGATGTTGTAGTTGTTGTAGTATGGGCTTTGATGTGTGCATTGCACTTG | | 25－CTA5－2－RCA－product | RCA | TCTCGGTCTGATGTTGTAGTTGTTGTAGTATGGGCTTTGATGTGTGCTGACCATTGCACTTG | | 25－CTA5－3－RCA－product | RCA | TCTCGGTCTGATGTTGTAGTTGTTGTAGTATGTTTGATGGGATGGGCTTTGATGTGTGCTGACCATTGCACTTG | | Reporter probe AT | CRISPR／Cas12a | 5＇－FAM－TTATTATT－BHQ1－3＇ | | Reporter probe AT－biotin | CRISPR／Cas12a | 5＇－FAM－TTATTATT－Biotin－3＇ | | RT1．2－has－miR－25－3p | RT－qPCR | GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC TCAGACC | | F1．2－has－miR－25－3p | RT－qPCR | GCG CATTGCACTTGTCTC | | RP－miR－universal | RT－qPCR | GTGCAGGGTCCGAGGT | | P1－has－miR－25－3p | RT－qPCR | 6＇FAM－TGGATACGAC TCAGA－MGB |
表 2．本研究中使用的 RNA 寡核苷酸
  寡肽   序列（5'－3'）
miR－25 CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA
miR－92a UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU
miR－25－1mismatch CAUUGCACUUAUCUCGGUCUGA
miR－155 UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGUU
miR－20a UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG
miR－199a CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC
miR－1246 AAUGGAUUUUUGGAGCAGG
miR－205－5p UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG
miR－191－5p CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG
crRNA20－1 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCAUACUACAACAACUACAAC
crRNA20－2 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGUCAGCACACAUCAAAGCCC
crRNA20－3 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCCCAUACUACAACAACUAC
crRNA20－4 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCACACAUCAAAGCCCAUACU
crRNA21－1 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCAUACUACAACAACUACAACA
crRNA21－2 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGUCAGCACACAUCAAAGCCCA
crRNA21－3 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCCCAUACUACAACAACUACA
crRNA21－4 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCACACAUCAAAGCCCAUACUA
Oligo name Sequence（5＇－3＇） miR－25 CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA miR－92a UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU miR－25－1mismatch CAUUGCACUUAUCUCGGUCUGA miR－155 UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGUU miR－20a UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG miR－199a CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC miR－1246 AAUGGAUUUUUGGAGCAGG miR－205－5p UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG miR－191－5p CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG crRNA20－1 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCAUACUACAACAACUACAAC crRNA20－2 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGUCAGCACACAUCAAAGCCC crRNA20－3 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCCCAUACUACAACAACUAC crRNA20－4 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCACACAUCAAAGCCCAUACU crRNA21－1 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCAUACUACAACAACUACAACA crRNA21－2 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGUCAGCACACAUCAAAGCCCA crRNA21－3 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCCCAUACUACAACAACUACA crRNA21－4 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCACACAUCAAAGCCCAUACUA| Oligo name | Sequence（5＇－3＇） | | :--- | :--- | | miR－25 | CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA | | miR－92a | UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU | | miR－25－1mismatch | CAUUGCACUUAUCUCGGUCUGA | | miR－155 | UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGUU | | miR－20a | UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG | | miR－199a | CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC | | miR－1246 | AAUGGAUUUUUGGAGCAGG | | miR－205－5p | UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG | | miR－191－5p | CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG | | crRNA20－1 | UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCAUACUACAACAACUACAAC | | crRNA20－2 | UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGUCAGCACACAUCAAAGCCC | | crRNA20－3 | UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCCCAUACUACAACAACUAC | | crRNA20－4 | UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCACACAUCAAAGCCCAUACU | | crRNA21－1 | UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCAUACUACAACAACUACAACA | | crRNA21－2 | UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGUCAGCACACAUCAAAGCCCA | | crRNA21－3 | UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCCCAUACUACAACAACUACA | | crRNA21－4 | UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCACACAUCAAAGCCCAUACUA |

  结果与讨论

RCA 的开发与优化

在我们的 RCA 基放大程序中，锁定挂锁探针（PP）利用微 RNA 作为夹子，在 splint R 连接酶的作用下形成环状模板（图 1A）。随后使用 phi29 DNA 聚合酶放大该环状 DNA 模板，生成含有重复序列的长单链 DNA。所得的串联聚合体含有大量互补的串联重复序列，这些序列与环状模板互补。miR25 的互补序列作为环状模板的一部分被放大。phi29 DNA 聚合酶具有链置换和高度
过程性聚合酶活性． 38 38 ^(38){ }^{38} 为了设计用于 RCA 的锁式探针，合成了一个长寡核苷酸，其中包含 CRISPR/Cas12a 的识别序列（蓝色）位于中间，两端则为 miRNA 互补序列（红色）．研究表明，锁式探针中的 PAM 序列具有抑制作用， 39 39 ^(39){ }^{39} 因此，未将其纳入 PP 设计。剩余的锁扣探针序列（黑色）设计为高 CA 含量，以最大化扩增效率并避免形成二级结构。研究表明，phi29 DNA 聚合酶在扩增 CA 富集的锁扣探针时效率极高。 4 − 42 4 − 42 ^(4-42){ }^{4-42} 基于上述标准，我们设计并合成了三种锁定探针用于评估，长度分别为 57nt（PP－CTA－1）、62nt（PP－CTA－2）和 74nt（PP－CTA－3）。图 1B 显示了使用不同锁定探针进行 RCA 以放大并检测 miR－25 的过程。PP－CTA－3 具有最高的相对荧光信号，因此被选为后续实验的探针．
接下来，我们优化了影响 RCA 效率的多个参数，包括缓冲液类型、padlock 探针用量、phi29 DNA 聚合酶及 splint R 连接酶的用量。首先，我们测试了 padlock 探针用量在 10 − 500 nM 10 − 500 nM 10-500nM10-500 \mathrm{nM} 范围内的效果（图 1C）。我们发现，当挂锁探针浓度为 500 nM 时，荧光信号最强，这可能是由于挂锁探针过量导致其与目标 miRNA 的结合亲和力增强。先前研究也表明，RCA 产物数量与挂锁探针浓度成正比。 43 43 ^(43){ }^{43} 50 nM 时荧光信号的轻微增加可能归因于反应波动，因其与 10 nM 和 100 nM 相比无统计学差异。
接下来，我们研究了四种不同缓冲溶液对 RCA 效率的影响（图 1D）。测试了 phi29 缓冲液、SplintR 缓冲液和 HOLMES1 缓冲液。结果显示，使用 SplintR 缓冲液时 RCA 效率最高。SplintR 缓冲液常与 SplintR ® ®  ^("® "){ }^{\text {® }} 连接酶配合使用，用于连接由互补 RNA 链夹持的相邻单链 DNA。 44 , 45 44 , 45 ^(44,45){ }^{44,45} 它含有 Tris-HCl、 MgCl 2 MgCl 2 MgCl_(2)\mathrm{MgCl}_{2} 、ATP 和 DTT 成分。我们还测试了 phi29 DNA 聚合酶的用量范围为 1 − 5 μ L 1 − 5 μ L 1-5muL1-5 \mu \mathrm{~L} 至 0.1 U / μ L 0.1 U / μ L 0.1U//muL0.1 \mathrm{U} / \mu \mathrm{L} （图 1E）。我们发现，phi29 DNA 聚合酶的最適用量为 1 μ L 1 μ L 1muL1 \mu \mathrm{~L} 。相反，过量的 phi29 DNA 聚合酶会抑制 RCA，表明过量的酶可能导致竞争性抑制。我们还在 1 − 4 μ L 1 − 4 μ L 1-4muL1-4 \mu \mathrm{~L} 到 0.1 U / μ L 0.1 U / μ L 0.1U//muL0.1 \mathrm{U} / \mu \mathrm{L} 的范围内测试了 splint R 连接酶（图 1F）。然而，splint R 连接酶的量对 RCA 的影响微乎其微。
在上述优化的 RCA 条件下，我们进行了
将 RCA 反应液在 37 ∘ C 37 ∘ C 37^(@)C37^{\circ} \mathrm{C} 条件下孵育 2 小时，随后在 65 ∘ C 65 ∘ C 65^(@)C65^{\circ} \mathrm{C} 条件下终止 RCA 反应 10 分钟。与其他扩增技术（如重组聚合酶扩增（RPA））相比，RCA 的反应动力学较慢，且需要更长时间才能扩增目标核酸。 46 46 ^(46){ }^{46} 2 小时是放大低丰度 miRNA 时不影响检测灵敏度的最短 RCA 反应时间。RCA 产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图 1G 所示。在样品加载区域附近观察到高分子量 DNA 条带，表明存在 RCA 生成的串联聚合体。值得注意的是，RCA 产物量与 miR-25 输入量成正比，证实了利用连接酶辅助 RCA 成功放大 miR-25。
接下来，我们通过测试不同微 RNA（图 1H）来验证 RCA 系统对微 RNA 的靶向特异性。由于锁芯探针设计用于靶向 miR-25，预期仅在 miR-25 中观察到高效的 RCA 反应，而在其他微 RNA 中则不应观察到。尽管在其他微 RNA（miR-199a、miR-155、miR-20a 和 miR-92a）中观察到一些微弱的背景荧光信号，但 miR-25 显示出显著更强的荧光信号。这表明我们 RCA 系统中使用的锁扣探针 PP-CTA-3 具有高靶向特异性。当在合成 miR-25 中引入单碱基突变（第 11 位 G 到 A）时，RCA 效率显著降低，表明我们的 RCA 系统具有强大的单碱基鉴别能力。先前研究已证实，padlock 探针可通过单核苷酸特异性有效区分 miRNA 家族成员。 40 , 47 40 , 47 ^(40,47){ }^{40,47}
图 1 RCA 设计与优化。 (A) RCA 设计示意图。 (B) RCA 用挂锁探针的筛选。优化 © 挂锁探针用量、(D) 缓冲液类型、(E) phi29 用量及 (F) splintR 用量。 (G) RCA 产物凝胶电泳图。 (H) 最优 RCA 的检测特异性。

CRISPR/Cas12a 的开发与优化

在此，我们使用了来自 Lachnospiraceae 细菌的 LbCas12a 核酸酶在 CRISPR/Cas12a 系统中。与 AsCas12a 一起，LbCas12a 是首个在人类细胞中报道具有高效基因编辑活性的 Cas12a 核酸酶。 34 34 ^(34){ }^{34} 两种 Cas12a 核酸酶常用于基于 CRISPR 的诊断技术中，用于检测核酸。 48 − 51 48 − 51 ^(48-51){ }^{48-51} LbCas12a 的 crRNA 由一个恒定茎环区域（环域）5’-UAUUUCUACUAAGUAGAU-3’和一个特异性结合区域（原间隔域）组成，后者识别靶微 RNA 中的匹配序列。恒定区域是与 Cas12a 蛋白相互作用以稳定 RNP 复合物的支架序列。crRNA 被设计为靶向垫锁探针上的四个不同位置（crRNA-1、crRNA-2、crRNA-3 和 crRNA-4）（图 2A）。我们还设计了不同长度的 crRNA（20nt 和 21nt）以靶向
挂锁探针。通过直接靶向合成挂锁探针，图 2B 显示，长度为 21 个核苷酸的 crRNA 展现出比长度为 20 个核苷酸的 crRNA 更高效的转切活性。这一发现与先前研究一致，即 Cas12a 的 crRNA 最优长度为 21 个核苷酸，尽管 20-25 个核苷酸范围内的 crRNA 仍具有功能性。 52 52 ^(52){ }^{52} 当这些 crRNA 用于靶向三种不同挂锁探针（cta5、cta5-2 和 cta5-3）时，crRNA-1 始终显示出强烈的荧光信号，无论使用哪种挂锁探针（图 2C）。为提升检测特异性和灵敏度，我们尝试将两种不同 crRNA 结合以实现双重识别和双信号放大。当以不同混合比例测试 crRNA-1 和 crRNA-2 时，发现 crRNA-1:crRNA-2 比例为 3 : 1 3 : 1 3:13: 1 时荧光信号最强，因此该 crRNA 比例被选用于后续实验（图 2D）。
图 2 Cas12a 与合成靶模板的 crRNA 筛选。 (A) 针对 padlock 探针设计的 crRNA 示意图。 (B) CRISPR/Cas12a 与不同 crRNA 结合后产生的荧光放大曲线及相对荧光强度。 (D) 两种不同 crRNA 联合使用产生的相对荧光信号。ARTICLE
在 crRNA 筛选后，我们优化了多个可能影响 CRISPR/Cas12a 性能的参数。首先，我们考察了 CRISPR/Cas12a 在不同类型缓冲液中的性能（图 3A）。Holmes1、Holmes2 和 NEB r2.1 缓冲液常用于 CRISPR/Cas12a 反应。 53 , 54 53 , 54 ^(53,54){ }^{53,54} splintR 缓冲液和 Tris－HCl 是 RCA 反应中常用的缓冲液． 55 , 56 55 , 56 ^(55,56){ }^{55,56} 如预期，Holmes1、Holmes2 和 NEB r2．1 缓冲液均适用于 CRISPR／Cas12a 反应。值得注意的是，RCA 反应中使用的 splintR 缓冲液也对 CRISPR／Cas12a 反应有效。考虑到将 RCA 和 CRISPR／Cas12a 混合物合并到单一反应管中，后续实验中选择了 splintR 缓冲液。相反，CRISPR/Cas12 缓冲液在两种混合物结合时会抑制 RCA 反应．
接下来，我们评估了 Cas12a 与 crRNA 的不同比例对核糖核蛋白（RNP）复合物形成的的影响（图 3B）。我们选取 crRNA：Cas12a 为 1：8 作为最优比例，尽管与 1：2 和 1：4 相比，统计学上无显著差异。先前研究中报道了不同的 crRNA：Cas12a 比例及多种浓度，表明 crRNA：Cas12a 比例存在较宽的适用范围，可用于 RNP 复合物组装。 57 − 59 57 − 59 ^(57-59){ }^{57-59} 随后，我们评估了报告探针和 MgCl 2 MgCl 2 MgCl_(2)\mathrm{MgCl}_{2} 浓度对 CRISPR/Cas12a 性能的影响。为产生强荧光信号，需使用高浓度的报告探针，因过量探针可促进转切活动（图 3C）。然而，进一步增加探针浓度会导致背景信号显著升高。
荧光信号和检测成本，因此，最佳报告探针量被固定为 2 μ M 2 μ M 2muM2 \mu \mathrm{M} 。尽管已报道了金属依赖性催化效应在转切裂活性的影响， 60 , 61 60 , 61 ^(60,61){ }^{60,61} ，但我们发现 MgCl 2 MgCl 2 MgCl_(2)\mathrm{MgCl}_{2} 浓度对 CRISPR/Cas12a 反应的影响微弱（图 3D）。因此，后续实验中采用最低 MgCl 2 MgCl 2 MgCl_(2)\mathrm{MgCl}_{2} 浓度，即 10 mM。
最后，我们使用这些优化参数评估了 CRISPR/Cas12a 系统的检测特异性和敏感性。除了目标合成锁链探针（cta5、cta5－2 和 cta5－3）外，我们还测试了其他无关的合成锁链探针（25－pp1、92a－pp1 和 92a－pp4），以验证 CRISPR／Cas12a 系统的靶向特异性（图 3E）．我们发现，我们的 CRISPR/Cas12a 系统仅在存在靶标合成挂锁探针时产生强荧光信号，表明优化后的 CRISPR/Cas12a 系统具有高靶向特异性。在确认靶向特异性后，我们通过测试不同浓度的 cta5-2 合成挂锁探针（浓度范围为 100 pM − 10 μ M 100 pM − 10 μ M 100pM-10 muM100 \mathrm{pM}-10 \mu \mathrm{M} ）来检测 CRISPR/Cas12a 系统的检测限（LOD）（图 3F）。我们的 CRISPR/Cas12a 系统能够检测到低至 1 nM 的目标合成挂锁探针。荧光强度与目标合成挂锁探针浓度成正比，相关系数为 0.9575。检测限（LOD）通过以下公式计算：目标探针浓度为 1 nM 时的荧光强度除以未靶向空白对照样本三次重复测量的标准差之和，再除以线性回归方程的斜率，结果为 1.315 pM．
图 3 CRISPR/Cas12a 反应体系的优化。优化（A）缓冲液类型、（B）crRNA 与 Cas12a 的摩尔比、（C）探针浓度以及（D）MgCl₂浓度对 CRISPR/Cas12a 反应的影响。检测（E）特异性和（F）灵敏度，以确定最佳 CRISPR/Cas12a 反应条件。

一锅法等温 CRISPR/Dx 系统的开发与优化

在分别优化 RCA 和 CRISPR/Cas12a 系统后，我们尝试将两种反应混合物在单一封闭管中结合，以实现一管式检测系统。该一管式检测系统采用共同反应缓冲液（splintR 缓冲液）和反应温度 ( 37 ∘ C ) 37 ∘ C (37^(@)C)\left(37^{\circ} \mathrm{C}\right) 。RCA 和 CRISPR/Cas12a 在 37 ∘ C 37 ∘ C 37^(@)C37^{\circ} \mathrm{C} 条件下反应 2 小时。首先，我们通过靶向 miR-25 和非相关 miRNA（miR-92a、miR-155、miR-20a 和 miR199a）验证了一体化 CRISPR/Dx 系统的检测特异性。此外，我们在合成 miR-25 中引入了单碱基突变（miR-25-1 mismatch）。我们证实，在靶标 miR-25 存在时，我们的单步 CRISPR/Dx 系统效率最高且产生最强的荧光信号（图 4A）。相反，当使用非相关 miRNA 时未检测到背景荧光信号。当在 miR-25 中引入点突变时，荧光信号显著下降，这表明我们的单步 CRISPR/Dx 系统具有高分辨能力和检测特异性。
随后，我们通过检测 miR-25 在 0.5 fM − 5 pM 0.5 fM − 5 pM 0.5fM-5pM0.5 \mathrm{fM}-5 \mathrm{pM} 浓度范围内的信号强度，确定了本研究中一锅法 CRISPR/Dx 系统的检测灵敏度（图 4B）。我们的 CRISPR/Cas12a 系统能够检测到低至 0.5 fM 的靶合成 miR-25。荧光强度与 miR-25 浓度呈正相关，相关系数为 0.9995（图 4C）。该回归直线在 miR-25 浓度范围内有效。

浓度范围在 0.5 − 500 fM 0.5 − 500 fM 0.5-500fM0.5-500 \mathrm{fM} 之间。检测限（LOD）通过以下方法计算：将未靶标空白对照样品三次重复测定的标准偏差乘以 3，再除以线性回归方程的斜率，所得值为 6.60 fM。

一锅法等温 CRISPR/Dx 系统的通用化

随后，我们评估了我们的单管 CRISPR/Dx 检测系统是否可推广用于检测其他 miRNA（miR-191、miR-205 和 miR-1246）。在此情况下，锁定探针两端的片段序列被修改为与 miR-191-5p、miR-205-5p 和 miR-1246 互补，而环状序列的其余部分保持不变。图 4D 显示，通过简单修改锁定探针部分序列，一锅法 CRISPR/Dx 检测系统可适应检测其他 miRNA。当进一步稀释 miR-1246 进行检测时，我们的单锅 CRISPR/Dx 系统可检测到低至 10fM 的靶合成 miR-1246（图 4E），表明该系统具有普适性和高检测灵敏度。综合上述结果，我们证实了单锅 CRISPR/Dx 系统具有优异的检测特异性和灵敏度。此外，该系统具有高度灵活性和经济性，因为相同的 crRNA 可用于检测任何 miRNA 序列，仅需对锁定垫锁探针进行少量修改。当与不同荧光报告探针结合时，还可实现 miRNA 的复检测出。
图 4 一步 RCA-CRISPR/Cas12a 的特异性和敏感性。检测（A）特异性和（B）灵敏度。© 一步法 RCA-CRISPR/Cas12a 的检测限（LOD）测定。 (D) 一步法 RCA-CRISPR/Cas12a 对其他微 RNA 的通用性。 (E) 一步法 RCA-CRISPR/Cas12a 检测其他微 RNA 的检测限（LOD）。

一锅法 CRISPR/Dx 系统在侧流条带纸检测平台及内源性 miRNA 检测中的应用

为了实现无需检测仪器（如荧光检测仪）的床旁检测（POCT），我们进一步测试了我们的单管 CRISPR/Dx 系统在侧流条纸检测平台上的可行性。商业化的侧流检测试纸条的使用实现了视觉读取、便携式诊断以及无需复杂实验室协议和高端设备的家庭自测。首先，我们通过检测不同 miRNA（miR-25、miR-155、miR-92a、miR-20a 和 miR-199a）来评估我们的一锅式 CRISPR/Dx 系统的检测特异性。我们还在合成 miR-25 中引入单碱基突变，以验证其单碱基分辨率特异性。图 5A 显示，载有 miR-25 的侧流试纸条上出现两条红色条带，而载有无关 miRNA 的试纸条上仅出现一条红色条带。值得注意的是，miR-92a 与 miR-25 在序列上高度同源。在加载单碱基错配的 miR-25 的侧流试纸上也显示出一条红色条带，这表明我们的单锅 CRISPR/Dx 系统具有高靶向特异性。这进一步证明了我们的单锅 CRISPR/Dx 系统具有单碱基分辨能力，且与同源 miRNA 无交叉反应。在测试我们的侧流
不同浓度 miR25（范围为 0.3 pM − 100 pM 0.3 pM − 100 pM 0.3pM-100pM0.3 \mathrm{pM}-100 \mathrm{pM} ）的条带纸检测方法显示，Tisbe 红强度与 miR-25 之间存在线性相关性（图 5B）。miRNA-25 浓度越高，T 线条带越深。侧流纸条检测方法的检测限（LOD）为 500 fM。尽管略低于荧光检测平台，但侧流纸条检测平台在资源匮乏和偏远地区更具便利性和可行性。
最后，我们应用了这一一锅式 CRISPR/Dx 系统检测人胰腺癌细胞系 PANC-1 中的 miR-25。多项研究表明，miR-25 在人胰腺癌细胞系中高度表达，是胰腺癌早期诊断的潜在生物标志物。 62 , 63 62 , 63 ^(62,63){ }^{62,63} 正常人肺上皮细胞系 BEAS-2B 作为对照组。当将我们的单步 CRISPR/Dx 系统应用于荧光和侧流条带纸基检测平台时，两者在 PANC-1 细胞系中均显示出强阳性信号，而在 BEAS-2B 中则显示为阴性信号（图 5C）。PANC-1 和 BEAS-2B 中 miR-25 的表达状态还通过茎环 RT-qPCR 方法得到了验证（图 5D）。 64 64 ^(64){ }^{64} 因此，我们的单步 CRISPR/Dx 系统可应用于荧光和侧流条带纸基检测平台，用于检测细胞内源性 miRNA，支持其在临床和 POCT 中的潜在应用。这为进一步测试临床样本奠定了坚实基础。
图 5 侧流条带纸检测平台在一步 RCA-CRISPR/Cas12a 反应中的应用。侧流条带纸的检测（A）特异性和（B）灵敏度。© 一步法 RCA-CRISPR/Cas12a 在胰腺癌细胞系中的应用。 (D) 一步法 RCA-CRISPR/Cas12a 与茎环 RT-PCR 的验证。左侧为茎环 RT-PCR 的检测原理；右侧为茎环 RT-PCR 与一步法 RCA-CRISPR/Cas12a 的比较。

  结论

综上所述，我们成功开发了一种基于 RCA 和 CRISPR/Cas12a 的一锅式等温 CRISPR/Dx 系统，可实现对 miR-25 的高特异性和高灵敏度检测。该一锅法 CRISPR/Dx 系统已成功应用于荧光检测和侧流条带纸基检测平台，检测限（LOD）分别为 6.60 fM 和 500 fM。该系统可区分含有单碱基突变的 miR-25 及高度同源的 miRNA 种类。此外，该系统已成功推广用于检测其他 miRNA，包括 miR-191、miR-205 和 miR-1246。此外，该系统具有高度灵活性和经济性，同一 crRNA 可用于检测不同 miRNA，仅需对锁定探针进行少量修改。除具备高检测灵敏度和特异性外，该系统还具有便携、可扩展和易于操作的优势。因此，该一锅式等温 CRISPR/Dx 检测系统有望在临床和 POCT 中用于多种人类癌症的诊断。

  作者贡献

H.Z. 和 C.Y. 概念设计、资金获取及监督；X.L.、Z.H.、C.H.L.、J.L.、M.Z.、W.W.、X.C.、J.L.Y.H.、T.W.、Y.L.、M.X. 和 X.H. 负责正式分析、调查、方法学、验证和可视化；X.L.、Z.H.、C.H.L.、J.L.、H.Z. 和 C.Y. 负责撰写初稿及审阅与编辑。所有作者均阅读、修改并批准了最终稿件。

  利益冲突

没有需要声明的冲突。

  数据可用性

本文所引用的数据已作为 ESI 的一部分纳入其中。 † † †\dagger

  致谢

本研究得到汕头大学科研启动基金项目（NTF20030）、广东省自然科学基金普通项目（2023A1515011906）和厦门市科学技术局国家高层次人才引进计划（QN2023021001L）的资助。

  注释与参考文献

1. 乔卡泽（N. Jokhadze）、达斯（A. Das）和迪松（D. S. Dizon），《癌症研究杂志》（CA Cancer J Clin），2024 年，第 74 卷，第 224-226 页。
2. R. L. 席格尔、A. N. 贾昆托和 A. 杰马尔，《加州癌症杂志临床版》，2024 年，第 74 卷，第 12-49 页。
3 L. 卡拉瓦塔，F. 切利尼，N. 西莫尼，C. 罗萨，R. M. 尼埃斯波洛，M. 卢帕特利，V. 皮卡尔迪，G. 马奇亚，A. 萨伊纳托，G. 曼特洛，F. 迪奥尼西，M. E. 罗塞托，V. 弗斯科，F. 纳瓦里亚、A. 德帕奥利、A. 圭多、C. 韦奇、R. 巴西利科、R. 恰恩奇、A. 德利皮齐、M. 迪尼科拉、G. C. 马蒂乌奇、V. 瓦伦蒂尼、A. G. 莫尔甘蒂和 D. 杰诺维西，《肿瘤学杂志》，2019，58，439-447。
4. M. I. 卡迪尔和 A. 法希姆，《真核基因表达评论》，2017 年，第 27 卷，第 197-204 页。
P. K. 蒂瓦里、P. シャンムガム、V. カルン、S. ガプタ、R. ミシュラ、S. ラストアギ、M. チョウハン、D. ヴェルマ、N2.K: 1thaoand $. Kunqae, 癌症（巴塞尔），2024, 16.
D. P. 巴特尔，《细胞》，2018，173，20-51。
L. A. 麦克法兰和 P. R. 墨菲，当前基因组学，2010，11，537-561。
刘 B., 张 X. 和 毛 AW., 生物科学前沿（标志性版），2015, 20, 1017-1028.
莫永泰、李志强和考克斯，临床与实验转移，2024，41，163-186。
孙 X，周 X，张 Y，朱 X 和刘 H，疾病标志物，2018，2018，6292396。
叶杰，徐明，田晓，蔡松，曾松，药学分析杂志，2019，9，217-226。
R. F. 基廷、M. 蒂斯特曼和 R. H. 普拉斯特克，《CSH 协议》，2006 年，2006 年。
施瓦茨科普夫（M. Schwarzkopf）和皮尔斯（N. A. Pierce），《核酸研究》（Nucleic Acids Research），2016 年，第 44 卷，e129。
J. M. 汤姆森、J. S. 帕克和 S. M. 汉密尔顿，《酶学方法》，2007 年，第 427 卷，第 107-122 页。
李伟，赵波，金勇和阮凯，生物化学与生物物理学报（上海），2010，42，296-301。
R. N. 阿姆斯特朗、H. A. 科利尔和 K. I. 米尔斯，《分子生物学方法》，2012 年，第 863 期，第 293-302 页。
P. 梅斯达赫、T. 费斯、N. 伯纳德、S. 根特尔、C. 陈、F. 斯佩勒曼和 J. 范德索姆佩尔，核酸研究，2008，36，e143。
石杰，刘松，李鹏，林勇，罗浩，吴勇，严建，黄建军和 X X XX . 谭，生物传感器与生物电子学，2023，237，115557。
王福泰、侯永永、谭晓、黄凯军、徐建和蔡瑞，生物传感器与生物电子学，2023，222，114933。
侯玉玉，徐建，王福泰，董志，谭晓，黄建军，李建清，左春云和张世清，分析化学，2021，93，15225-15230.
H. L. 帅, K. J. 黄, Y. X. 陈, L. X. 方和 M. P. 贾, 生物传感器与生物电子学, 2017, 89, 989-997.
唐东，石军，吴勇，罗红，严建，黄建军和谭晓，分析化学，2023，95，16374-16382.
徐杰，刘勇，黄凯杰，侯永永，孙晓，李军，分析化学，2022，94，16980-16986.
徐杰，刘勇，李勇，刘勇和黄建军，分析化学，2023，95，13305-13312.
V. V. Demidov, 《分子诊断学专家评论》，2002 年，第 2 期，第 542-548 页。
徐丽，段建，陈杰，丁松和程伟，分析化学通讯，2021，1148，238187。
刘瑞，王晓，王松，谢亮，赵鹏，李亮，葛松和于建，分析化学通讯，2024，1287，342125。
刘 X，赵 X，袁 Y，曹 Z，朱 M，李 T 和吴 Z，胸科疾病杂志，2022，14，4427-4434。
牛 C., 刘 J., 邢 X. 和 张 C., 生物材料研究, 2023, 5, 0010.
清明，陈世龙，孙志，范勇，罗海清和李宁波，分析化学，2021，93，7499-7507。
王瑞，赵晓，陈晓，邱晓，清刚，张红，张丽，胡晓，何志，钟东，王勇和罗勇，分析化学，2020，92，2176-2185.
吴 Z. 和 赵 S., 应用生物化学与生物技术, 2024, 196, 3115-3125.
周思，孙浩，董杰，卢鹏，邓亮，刘洋，杨明，霍大，侯春，分析化学通讯，2023，1265，341278.
B. 采特切，J. S. 古滕伯格，O. O. 阿布达耶赫，I. M. 斯莱梅克，K. S. 马卡罗娃，P. 埃斯莱茨比克勒，S. E. 沃尔兹，J.

数据可用性声明

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  1. a a ^(a){ }^{a} 福建医科大学肿瘤临床医学院，福建医科大学，福州市，福建省，中国
    b b ^(b){ }^{b} 福建医科大学附属泉州第一医院 胃肠外科，福建省泉州市，中国
    c c ^(c){ }^{c} 生物学系，科学学院，汕头大学，汕头，广东，中国
    d d ^(d){ }^{d} 厦门飞基因生物技术有限公司，生物医药产业园，厦门，福建，中国
    e e ^(e){ }^{e} 广东省海洋生物技术重点实验室，汕头大学，汕头，广东，中国
    f f ^(f){ }^{f} 结直肠外科，肿瘤临床医学学院，福建医科大学，福州市，福建省，中国
    g g ^(g){ }^{g} 结直肠外科，福建省肿瘤医院，福州市，福建省，中国 \＃共同贡献
      ＊通讯作者
    杨春康（chunkang129＠fjmu．edu）；朱海波（zhuhaibao＠stu．edu．cn）