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Metadherin 基因沉默可抑制脂多糖/三磷酸腺苷刺激的肾小管上皮细胞焦亡

段秀萍 1 1 ^(1){ }^{1} ，宋雅珊 1 1 ^(1){ }^{1} ，李福记，廖蕴华*，刘文婷*广西医科大学第一附属医院肾内科，南宁 530022

文章信息

关键词：

Metadherin
NRK-52E 细胞
核因子κB
细胞焦亡

摘要

细胞焦亡通过 NLRP3 炎症小体的激活在炎症反应后发生。脂多糖（LPS）诱导的急性炎症会导致肾小管上皮细胞发生焦亡，从而加剧肾脏损伤，并参与多种肾脏疾病的病理生理过程。异黏蛋白（Mtdh）通过激活 NLRP3 炎症小体诱发炎症反应，具体而言，它通过激活核因子κB（NF-кB）信号通路（该通路参与 NLRP3 炎症小体的激活）引发肾脏炎症损伤。然而，Mtdh 在肾小管上皮细胞焦亡中的作用尚不明确。为此，我们研究了 Mtdh 是否通过激活 NLRP3 炎症小体和 NF-кB 信号通路参与 LPS/三磷酸腺苷（ATP）处理的 NRK-52E 细胞焦亡过程。我们采用 LPS/ATP 诱导 NRK-52E 细胞发生焦亡后，通过小干扰 RNA 转染沉默 Mtdh 表达。结果显示，LPS/ATP 会上调 Mtdh 表达并诱导 NRK-52E 细胞发生焦亡及 NLRP3 炎症小体激活，而抑制 Mtdh 表达可减轻 LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞焦亡程度。 此外，NLRP3 炎症小体及 NF-кB 信号通路的激活受到抑制。这表明 Mtdh 表达下调通过抑制 NF-кB 信号通路来阻断 NLRP3 炎症小体的活化，从而抑制 LPS/ATP 处理的 NRK52E 细胞发生焦亡。

1. 引言

焦亡是一种程序性细胞死亡方式，其特征表现为细胞持续膨胀直至细胞膜破裂，导致细胞内容物释放并引发强烈炎症反应。肾小管上皮细胞焦亡在多种肾脏疾病的发病机制中起关键作用。最新研究表明，糖尿病肾病和急性肾损伤小鼠模型的肾小管上皮细胞中均存在焦亡现象，这种细胞死亡方式会加剧肾小管损伤（Wang 等，2019；Ye 等，2019；Zhang 等，2018）。此外，肾小管上皮细胞焦亡还会放大炎症反应并加速
梗阻性肾病中肾纤维化进展的重要机制（Li 等，2021）。因此，进一步探索细胞焦亡在肾脏疾病中的致病机制对寻找潜在治疗靶点具有重要意义。细胞焦亡通过经典和非经典途径被激活。该过程通常由已被广泛研究的经典途径中 gasdermin D（GSDMD）裂解和 NLRP3 炎症小体激活介导，这与凋亡和坏死不同（Shi 等，2017）。NLRP3 炎症小体是由 NLRP3、含 caspase 募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和 caspase-1 组成的大型蛋白质复合物（Kim 等，2017）。当细胞暴露于内源性或外源性危险信号时，NLRP3/ASC/procaspase-1 蛋白复合物会
通过经典途径组装而成。随后，procaspase-1 会自我裂解为活化形式，活化的 caspase-1 进而切割并释放白细胞介素（IL）-1β和 IL-18 的前体至细胞外空间（Xue 等，2019）。活化的 caspase-1 直接参与 gasdermin-N 和 gasdermin-C 结构域的切割。随后，释放的 gasdermin-N 结构域与质膜中的肌醇磷酸结合，并在细胞膜上寡聚化形成膜孔，从而诱导细胞焦亡（Rathinam 等，2019；Vande Walle 和 Lamkanfi，2016）。炎症的激活会诱导细胞发生焦亡，而焦亡又会放大炎症反应，加剧对细胞和组织的损伤。
大量研究表明，核因子κB（NF-κB）信号通路参与细胞焦亡的激活过程（Jiang 等，2020；Shao 等，2020；Tian 等，2021）。此外，NF-κB 信号通路被认为是启动 NLRP3 炎症小体活化的驱动力，进而引发炎症反应（Jo 等，2016；Yi 等，2017）。NLRP3 基因在转录起始位点附近具有 NF-κB 结合位点，该位点对脂多糖（LPS）表现出敏感性（Boaru 等，2015）。NF-κB 信号通路的激活可调控 NLRP3 的转录，从而诱导 NLRP3 和 pro-IL-1β的表达（Qiao 等，2012；Wang 等，2018）。随后在腺苷三磷酸（ATP）、病毒 RNA 和孔道毒素等其他触发信号的刺激下，NLRP3 炎症小体完成组装并激活。
研究证实，原癌基因 metadherin（Mtdh，又称 AEG-1/LYRIC）的过表达可通过激活 Wnt/β-catenin、磷酸肌醇 3-激酶/Akt 和 NF-κB 信号通路调控癌症中的多种病理过程（Hu 等，2009；Sarkar 和 Fisher，2013）。Mtdh 还被认为是炎症的新型调节因子（Lee 等，2013），其过表达通过调控结肠炎中 Toll 样受体信号加重肠道炎症和损伤（Wang 等，2021）。此外，Mtdh 通过 NF-κB 信号通路加速 LPS 刺激的软骨细胞炎症反应（Qing 等，2019）。研究还表明，Mtdh 通过激活 NF-κB 信号参与 2 型糖尿病小鼠的肾脏炎症性损伤（Liu 等，2019）。另有报道显示，Mtdh 在体外通过调节骨形态发生蛋白/Smad 1/5/9 信号诱导肾纤维化（Peng 等，2019a）。这些发现表明 Mtdh 在多种肾脏疾病的病理过程中发挥重要作用。 此外，近期研究表明 Mtdh 通过激活 NLRP3 炎症小体参与调控黏膜屏障损伤和小鼠子宫内膜异位症病灶中的炎症反应（Peng 等，2019b；Zhao 等，2019）。然而，Mtdh 是否调控 LPS/ATP 处理的肾小管上皮细胞焦亡仍需进一步研究，其潜在的分子机制也有待阐明。
本研究通过 siRNA 沉默 LPS/ATP 刺激的 NRK-52E 细胞中 Mtdh 表达后，评估细胞焦亡发生情况、NF-кB 信号通路及 NLRP3 炎症小体激活状态，验证了 Mtdh 通过激活 NF-кB 信号通路依赖 NLRP3 炎症小体途径调控 LPS/ATP 诱导的肾小管上皮细胞焦亡这一假说。

2. 材料与方法

2.1. 细胞培养与 LPS/ATP 处理

NRK-52E 细胞（CL-0174）由普诺赛生命科技有限公司（中国武汉）惠赠。细胞培养于含 5 % 5 % 5%5 \% 胎牛血清（Gibco，美国纽约州格兰德岛）和 10 % 10 % 10%10 \% 双抗（Solarbio，中国北京）的高糖 DMEM 培养基（普诺赛生命科技有限公司）中，置于恒温培养箱（ 37 ∘ C , 5 % CO 2 37 ∘ C , 5 % CO 2 37^(@)C,5%CO_(2)37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} ，饱和湿度）培养。对照组细胞在含 5 % 5 % 5%5 \% 胎牛血清的高糖 DMEM 培养基中培养 24 小时且不作任何处理。
其他组 NRK-52E 细胞分别用 LPS（ 30 μ g / mL 30 μ g / mL 30 mug//mL30 \mu \mathrm{~g} / \mathrm{mL} ，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯市）预处理 23、11 或 5 小时后，向培养体系中加入 ATP（5 mM，Sigma-Aldrich）继续处理 1 小时。另一些实验中，细胞经 LPS 处理 11 小时后，加入 ATP 继续培养 1 小时。

2.2 细胞转染

当 NRK-52E 细胞达到 50 % 50 % 50%50 \% 汇合度时，按照制造商说明书使用 PepMute TM TM ^(TM){ }^{\mathrm{TM}} siRNA 转染试剂（SignaGen Laboratories，美国马里兰州罗克维尔市）转染 siRNA（NC、917 和 1003）。转染前 30 分钟将培养基更换为含 5 % 5 % 5%5 \% 胎牛血清的新鲜完全培养基。随后将 5 × 5 × 5xx5 \times 转染缓冲液 100 μ L 100 μ L 100 muL100 \mu \mathrm{~L} 稀释至 1 × 1 × 1xx1 \times 后，与 0.4 μ L 0.4 μ L 0.4 muL0.4 \mu \mathrm{~L} siRNA（ 20 μ M 20 μ M 20 muM20 \mu \mathrm{M} ）和 2.6 μ L 2.6 μ L 2.6 muL2.6 \mu \mathrm{~L} PepMute 试剂混合。充分混匀后静置 15 分钟，再将混合物加入细胞中。接着将细胞孵育 12 小时。此后更换为含 2 % 2 % 2%2 \% 胎牛血清的完全培养基，并用 LPS 刺激细胞 11 小时，再用 ATP 处理 1 小时。用于沉默 Mtdh 的 siRNA 及阴性对照（NC）siRNA 由吉玛基因（中国上海）制备。siRNA 序列列于表 1。

2.3. 细胞活力分析

采用 Cell Counting Kit-8（CCK8；日本熊本同仁化学）检测 NRK-52E 细胞活力，操作步骤参照试剂盒说明书。向细胞中加入 CCK8 试剂孵育 2 小时后，使用酶标仪在 450 nm 波长处测定吸光度值。

2.4. 逆转录实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）

使用 RNA 提取试剂盒（日本 Takara Bio 公司）从 NRK-52E 细胞中提取总 mRNA，采用紫外分光光度计测定 RNA 浓度与纯度。随后按照逆转录试剂盒（Takara Bio 公司）说明书合成单链 cDNA。采用 2 − Δ Δ 2 − Δ Δ 2^(-Delta Delta)2^{-\Delta \Delta} Cq Cq ^(Cq){ }^{\mathrm{Cq}} 方法测定 mRNA（以甘油醛-3-磷酸脱氢酶[GAPDH]为内参）的表达水平，本研究使用的扩增引物序列列于表 2。

2.5. 蛋白质免疫印迹实验

使用蛋白质提取试剂盒（Genstar，中国）和 BCA 蛋白定量试剂盒（Genstar）分别提取并测定 NRK-52E 细胞中的总蛋白含量，操作严格遵循制造商说明书。通过 10 % 10 % 10%10 \% 凝胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上，室温下用 5 % 5 % 5%5 \% 脱脂牛奶封闭 1 小时。随后与 Mtdh（1:1000；Abcam）、NLRP3（1:1000；ABclonal）等一抗进行孵育。
表1
siRNA 序列
siRNA（大鼠） 正义链 (5'-3') 反义链 (5'-3')
si-Mtdh (917) CAACAGCGUAAACGUGAUATT UAUCACGUUUACGCUGUUGTT
si-Mtdh (1003) CACCGAGCAACUUACAACUTT AGUUGUAAGUUGCUCGGUGTT
si-NC AGUUGUAAGUUGCUCGGUGTT ACGUGACACGUUCGGAGAATT
siRNA (rat) Sense (5'-3') Antisense (5'-3') si-Mtdh (917) CAACAGCGUAAACGUGAUATT UAUCACGUUUACGCUGUUGTT si-Mtdh (1003) CACCGAGCAACUUACAACUTT AGUUGUAAGUUGCUCGGUGTT si-NC AGUUGUAAGUUGCUCGGUGTT ACGUGACACGUUCGGAGAATT| siRNA (rat) | Sense (5'-3') | Antisense (5'-3') | | :--- | :--- | :--- | | si-Mtdh (917) | CAACAGCGUAAACGUGAUATT | UAUCACGUUUACGCUGUUGTT | | si-Mtdh (1003) | CACCGAGCAACUUACAACUTT | AGUUGUAAGUUGCUCGGUGTT | | si-NC | AGUUGUAAGUUGCUCGGUGTT | ACGUGACACGUUCGGAGAATT |
表2
引物序列
基因（大鼠） 正向引物（5'-3'） 反向引物（5'-3'）
GAPDH TCCGCCCCTTCCGCTGATG TCCGCCCCTTCCGCTGATG
Mtdh CTCTCGGGTTGCTGCTTCTCTTC TCCCAGCAAACCTATCCACTCCTC
NLRP3 GCAGCGATCAACAGGCGAGAC TCCCAGCAAACCTATCCACTCCTC
ASC TGGTTTGCTGGATGCTCTGTATGG ACAAGTTCTTGCAGGTCAGGTTCC
IL-1 β β beta\beta CTCACAGCAGCATCTCGACAAGAG TCCACGGGCAAGACATAGGTAGC
IL-18 CGACCGAACAGCCAACGAATCC TCACAGATAGGGTCACAGCCAGTC
Gene (rat) Forward primer (5'-3') Reverse primer (5'-3') GAPDH TCCGCCCCTTCCGCTGATG TCCGCCCCTTCCGCTGATG Mtdh CTCTCGGGTTGCTGCTTCTCTTC TCCCAGCAAACCTATCCACTCCTC NLRP3 GCAGCGATCAACAGGCGAGAC TCCCAGCAAACCTATCCACTCCTC ASC TGGTTTGCTGGATGCTCTGTATGG ACAAGTTCTTGCAGGTCAGGTTCC IL-1 beta CTCACAGCAGCATCTCGACAAGAG TCCACGGGCAAGACATAGGTAGC IL-18 CGACCGAACAGCCAACGAATCC TCACAGATAGGGTCACAGCCAGTC| Gene (rat) | Forward primer (5'-3') | Reverse primer (5'-3') | | :--- | :--- | :--- | | GAPDH | TCCGCCCCTTCCGCTGATG | TCCGCCCCTTCCGCTGATG | | Mtdh | CTCTCGGGTTGCTGCTTCTCTTC | TCCCAGCAAACCTATCCACTCCTC | | NLRP3 | GCAGCGATCAACAGGCGAGAC | TCCCAGCAAACCTATCCACTCCTC | | ASC | TGGTTTGCTGGATGCTCTGTATGG | ACAAGTTCTTGCAGGTCAGGTTCC | | IL-1 $\beta$ | CTCACAGCAGCATCTCGACAAGAG | TCCACGGGCAAGACATAGGTAGC | | IL-18 | CGACCGAACAGCCAACGAATCC | TCACAGATAGGGTCACAGCCAGTC |
caspase-1（1:1000；艾博抗），ASC（1:1000；ImmunoWay 公司），IL-1β（1:1000；ImmunoWay 公司），IL-18（1:1000；博奥森），GSDMD-N（1:1000；亲和力生物），p-P65（1:1000；亲和力生物）和 GAPDH（1:1000；CST 公司）抗体 4℃孵育过夜。次日室温下用 HRP 标记二抗孵育膜 1 小时，最后使用增强化学发光液显色，凝胶成像系统采集图像。

2.6. 免疫荧光染色

细胞爬片经 4%多聚甲醛固定 15 分钟，0.5% Triton X-100 透化 10 分钟。随后加入 5%胎牛血清室温封闭 2 小时，湿盒中 4℃过夜孵育 GSDMD-N（1:200；亲和力生物）、Mtdh（1:100；艾博抗）和 P65（1:200； Proteintech）抗体。避光条件下室温孵育 Alexa Fluor 594 标记二抗 1 小时及 DAPI 染核 10 分钟，最后于荧光显微镜下观察。

2.7. 流式细胞术

采用 FITC Annexin V 凋亡检测试剂盒（美国 BD Biosciences 公司）按说明书操作，通过流式细胞术检测异硫氰酸荧光素（FITC）和碘化丙啶（PI）双阳性 NRK-52E 细胞。处理后，消化收集 NRK52E 细胞并用磷酸盐缓冲液洗涤。细胞沉淀重悬于 100 μ L 100 μ L 100 muL100 \mu \mathrm{~L} 缓冲液 ( 1 × ) ( 1 × ) (1xx)(1 \times) 中，避光条件下加入 3 μ L 3 μ L 3muL3 \mu \mathrm{~L} PI 和 3 μ L 3 μ L 3muL3 \mu \mathrm{~L} FITC，室温孵育 15 分钟。最后加入 400 μ L 400 μ L 400 muL400 \mu \mathrm{~L} 缓冲液（ 1 × 1 × 1xx1 \times ），使用流式细胞仪（美国 BD Biosciences 公司）进行分析。

2.8 统计学分析

采用 SPSS 20.0 软件（美国 IBM 公司）进行统计分析。符合正态分布的数据以均值±标准差表示（至少 3 次独立实验）。组间比较采用 Student's t t tt 检验，多组间比较采用方差分析。P 值 ≤ 0.05 ≤ 0.05 <= 0.05\leq 0.05 认为具有统计学意义。

3 结果

3.1. LPS/ATP 诱导 NRK-52E 细胞 NLRP3 炎症小体激活及细胞焦亡

我们首先评估了 LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞中 NLRP3 炎症小体激活及细胞焦亡情况。NRK-52E 细胞的存活率
图 1. LPS/ATP 诱导 NRK-52E 细胞 NLRP3 炎症小体激活及细胞焦亡。(A)NRK-52E 细胞经 LPS 处理 11 小时后，再添加 ATP 继续处理 1 小时的细胞存活率。(B)不同时间 LPS/ATP 处理后 NRK-52E 细胞中 NLRP3、ASC、IL-1 β β beta\beta 、IL-18 的 mRNA 表达水平。(C)不同时间 LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞中 NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1 β β beta\beta 和 IL-18 蛋白表达的 Western blotting 检测及其定量分析。(D,E)不同时间 LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞中 GSDMD-N 蛋白表达的 Western blotting 检测及其定量分析。数据以三次独立实验结果的均值 ± ± +-\pm 标准差表示。与对照组细胞数据相比，*表示 P ≤ 0.05 P ≤ 0.05 P <= 0.05\mathrm{P} \leq 0.05 ，**表示 P ≤ 0.01 P ≤ 0.01 P <= 0.01\mathrm{P} \leq 0.01 ，***表示 P ≤ 0.001 P ≤ 0.001 P <= 0.001\mathrm{P} \leq 0.001 。
经 LPS/ATP 处理的细胞存活率低于对照组（图 1A）。蛋白质印迹和实时荧光定量 PCR 结果显示，LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞中 NLRP3、ASC 和 caspase-1 的表达水平显著升高；IL-1β和 IL-18 的表达水平也有所增加（图 1B 和 C）。此外，我们观察到 LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞中 GSDMD-N 表达显著上调（图 1D 和 E）。这些结果表明 LPS/ATP 可诱导细胞发生焦亡并激活 NLRP3 炎症小体。本研究发现 12 − h 12 − h 12-h12-\mathrm{h} 浓度的 LPS/ATP 处理对诱导炎症和焦亡具有最显著效果，因此后续实验选择该处理条件进行假设验证。

3.2 LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞中 Mtdh 表达升高

通过免疫荧光染色、RT-qPCR 和蛋白质印迹分析评估了 LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞中 Mtdh 的表达情况。免疫荧光染色结果显示，LPS/ATP 处理组细胞中 Mtdh 表达增加（图 2A）。与此一致的是，LPS/ATP 处理组细胞的 Mtdh mRNA 和蛋白表达水平均显著高于对照组（图 2B 和 C）。
3.3. Mtdh 基因沉默抑制 LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞焦亡
我们通过沉默 NRK-52E 细胞中的 Mtdh 进一步研究其在细胞焦亡中的作用。RT-qPCR 和蛋白质印迹分析显示 siRNA 有效抑制了 Mtdh 表达。转染 Mtdh siRNA（si-Mtdh，编号 917 和 1003）的 NRK-52E 细胞中 Mtdh 表达量显著低于阴性对照组细胞（图 3A 和 B）。转染 si-Mtdh 的 NRK-52E 细胞存活率高于阴性对照组（图 3C）。此外，沉默 Mtdh 使 LPS/ATP 处理后的 NRK-52E 细胞存活率提升（图 3D-F）。流式细胞术数据显示，LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞中 FITC 与 PI 双阳性细胞比例升高，但 Mtdh 沉默后该比例下降（图 3G）。si-Mtdh 转染组与阴性对照组的 GSDMD-N 水平无显著差异（图 3H）。然而 Mtdh 沉默导致 LPS/ATP 处理后细胞中 GSDMD-N 表达下调（图 3I）。免疫荧光染色图像同样显示，当 Mtdh 表达被抑制时，LPS/ATP 处理细胞中的 GSDMD-N 表达降低（图 3J）。 这些结果表明，Mtdh 在 LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞中对调节细胞焦亡起重要作用。然而，在未经处理的 NRK-52E 细胞中，沉默 Mtdh 后细胞焦亡未受影响。
图 2. LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞中 Mtdh 表达增加。(A)显示 NRK-52E 细胞中 Mtdh 表达的免疫荧光染色图像。(B)LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞中 Mtdh 的 mRNA 表达水平。(C)LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞中 Mtdh 蛋白的 Western blotting 检测及其定量分析。数据以三次独立实验结果的均值±标准差表示。*表示 P ≤ 0.05 P ≤ 0.05 P <= 0.05\mathrm{P} \leq 0.05 ，**表示 P ≤ 0.01 P ≤ 0.01 P <= 0.01\mathrm{P} \leq 0.01 ，***表示 P ≤ 0.001 P ≤ 0.001 P <= 0.001\mathrm{P} \leq 0.001 （与对照组细胞数据相比）。
图 3. Mtdh 基因沉默可抑制 LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞焦亡。(A、B)分别通过 RT-qPCR 和蛋白质印迹分析显示转染 siRNA（NC、917 和 1003）的 NRK-52E 细胞中 Mtdh 的 mRNA 和蛋白表达水平。(C)转染 siRNA（NC、917 和 1003）的 NRK-52E 细胞存活率。(D、E)分别通过 RT-qPCR 和蛋白质印迹分析显示 LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞转染 siRNA（NC、917 和 1003）后 Mtdh 的 mRNA 和蛋白表达水平。(F)LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞转染 siRNA（NC、917 和 1003）后的存活率。(G)流式细胞术分析转染 siRNA（NC、917 和 1003）并经 LPS/ATP 处理后 FITC 与 PI 双阳性 NRK-52E 细胞比例，右上象限显示双阳性细胞占比。(H、I)蛋白质印迹检测转染 siRNA（NC、917 和 1003）的 NRK-52E 细胞在 LPS/ATP 处理前后 GSDMD-N 蛋白表达水平及定量分析结果。数据以三次独立实验结果的均值±标准差表示。 *表示与 NC 细胞相比数据达到 P ≤ 0.05 P ≤ 0.05 P <= 0.05\mathrm{P} \leq 0.05 显著性水平，**表示 P ≤ 0.01 P ≤ 0.01 P <= 0.01\mathrm{P} \leq 0.01 ，***表示 P ≤ 0.001 P ≤ 0.001 P <= 0.001\mathrm{P} \leq 0.001 ；+表示与 NC + LPS/ATP 细胞相比数据达到 P ≤ 0.05 , + + P ≤ 0.05 , + + P <= 0.05,++\mathrm{P} \leq 0.05,++ 显著性水平，++表示 P ≤ 0.01 P ≤ 0.01 P <= 0.01\mathrm{P} \leq 0.01 ，+++表示 P ≤ 0.001 P ≤ 0.001 P <= 0.001\mathrm{P} \leq 0.001 。（J）免疫荧光染色图像显示转染 siRNA（NC、917 和 1003）的 LPS/ATP 处理 NRK-52E 细胞中 Mtdh 与 GSDMD-N 的表达情况。

3.4 Mtdh 基因沉默通过抑制 NLRP3 炎症小体激活减轻 LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞焦亡

NLRP3 炎症小体的激活会引发细胞内炎症反应，这在细胞焦亡过程中起关键作用。RT-qPCR（图 4A）和蛋白质印迹（图 4B）分析显示，转染 si-Mtdh 的 NRK-52E 细胞中 NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1 β β beta\beta 和 IL-18 的表达水平均降低。此外，在 LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞中，Mtdh 表达下调使 NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1 β β beta\beta 和 IL-18 水平较对照组细胞显著降低（图 4C 和 D）。这些结果表明，Mtdh 基因沉默通过抑制 NLRP3 炎症小体激活，减轻了 LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞焦亡。

3.5. Mtdh 基因沉默通过 N F − κ B N F − κ B NF-kappa BN F-\kappa B 信号通路抑制 NLRP3 炎症小体激活

为进一步验证 LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞中 Mtdh 诱导的细胞焦亡是否由 NF- κ B κ B kappa B\kappa B 信号通路介导，我们检测了 p-P65 的表达水平。LPS/ATP 处理后细胞中 p-P65 表达显著增加（图 5A）。此外，无论是否接受 LPS/ATP 处理，下调 Mtdh 表达均导致 NRK-52E 细胞中 p-P65 表达降低（图 5B 和 C）。免疫荧光染色图像显示，LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞中 P65 核转位增加，而抑制 Mtdh 表达后该现象减弱
（图 5D）。这些结果表明，Mtdh 通过激活 NF- κ B κ B kappa B\kappa B 信号通路，参与了 NLRP3 炎症小体激活介导的细胞焦亡和炎症反应。

4. 讨论

本研究中，我们采用 LPS/ATP 诱导 NRK-52E 细胞发生焦亡，发现 NF- κ B κ B kappaB\kappa \mathrm{B} 信号通路与 NLRP3 炎症小体同时被激活。在此过程中，细胞内的 Mtdh 表达水平显著上升。实验数据显示，当抑制 Mtdh 表达时，LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞焦亡现象明显减轻。此外，NF- κ B κ B kappaB\kappa \mathrm{B} 信号通路与 NLRP3 炎症小体的活化也受到抑制。研究结果表明，沉默 Mtdh 基因可通过抑制 NF- κ B κ B kappaB\kappa \mathrm{B} 信号通路来阻断 NLRP3 炎症小体的激活，从而有效抑制 LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞焦亡过程。
肾小管是肾脏的重要组成部分，易受缺血、高血糖和高尿酸血症等病理状态的影响。肾小管上皮细胞焦亡是导致肾小管损伤的主要原因，并参与多种肾脏疾病的病理过程（Chi 等，2020；Lin 等，2020；Zhang 等，2021）。最新研究表明，在急性肾损伤中，肾小管上皮细胞焦亡由 caspase-11 介导（Miao 等，2019；Yang 等，2014）。焦亡会导致肾小管上皮细胞损伤和肾功能恶化，并参与糖尿病肾病和梗阻性肾病的发病机制（Li 等，2017；Song 等，2019）。受损的肾小管上皮细胞
图 4. Mtdh 基因沉默通过抑制 NLRP3 炎症小体活化减轻 LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞焦亡。(A) RT-qPCR 分析转染 siRNA（NC、917 和 1003）的 NRK-52E 细胞中 NLRP3、ASC、IL-1 β β beta\beta 和 IL-18 mRNA 表达定量。(B) 转染 siRNA（NC、917 和 1003）的 NRK-52E 细胞中 NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1 β β beta\beta 和 IL-18 蛋白表达的 Western blot 检测及定量分析结果。(C) RT-qPCR 测定转染 siRNA（NC、917 和 1003）并经 LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞中 NLRP3、ASC、IL-1 β β beta\beta 和 IL-18 mRNA 表达水平。(D) 转染 siRNA（NC、917 和 1003）并经 LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞中 NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1 β β beta\beta 和 IL-18 蛋白表达的 Western blot 检测及定量分析结果。数据以三次独立实验结果的均值 ± ± +-\pm 标准差表示。与 NC 组细胞数据相比，*表示 P ≤ 0.05 , ∗ ∗ P ≤ 0.05 , ∗ ∗ P <= 0.05,^(****)\mathrm{P} \leq 0.05,{ }^{* *} ， P ≤ 0.01 P ≤ 0.01 P <= 0.01\mathrm{P} \leq 0.01 表示 ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ^(******){ }^{* * *} ， P ≤ 0.001 P ≤ 0.001 P <= 0.001\mathrm{P} \leq 0.001 表示具有统计学差异。 +表示与 NC + LPS/ATP 组相比 P<0.05，++表示P<0.01，+++表示P<0.001
图 5. Mtdh 基因沉默通过 NF-κB 信号通路抑制 NLRP3 炎症小体激活。(A) LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞中κBα蛋白表达的 Western blot 检测及定量分析结果。(B,C) 转染 siRNA（NC、917 和 1003）的 NRK-52E 细胞在 LPS/ATP 处理前后的 p-P65 表达水平。数据以均值±标准差表示，来自三次独立实验。*表示与 NC 组或对照组相比 P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001；+表示与NC + LPS/ATP组相比P<0.05，++表示P<0.01，+++表示P<0.001。(D) 免疫荧光染色图像显示LPS/ATP处理的NRK-52E细胞在转染siRNA（NC、917和1003）后P65核转位情况。
产生多种生物活性因子并引发炎症反应和纤维化，从而加速肾脏疾病的进展（Liu 等，2018）。本研究中，我们采用 LPS/ATP 诱导肾小管上皮细胞发生焦亡，并以此探究 Mtdh 的作用。
据报道，通过经典途径激活 NLRP3 炎症小体对细胞焦亡至关重要（Yu 等，2020）。此外，NF- κ B κ B kappaB\kappa \mathrm{B} 信号通路的刺激是激活 NLRP3 炎症小体的驱动力（Boaru 等，2015；Chen 等，2019）。NF- κ κ kappa\kappa B 信号通路在炎症和细胞焦亡的调控中也起着关键作用（El-Sisi 等，2021；Liu 等，2017；Xu 等，2020）。我们的研究结果显示，经 LPS/ATP 处理后，NRK-52E 细胞的活力下降，而 FITC 和 PI 双阳性细胞比例增加。GSDMD-N 的表达也上调，这表明 LPS/ATP 成功诱导了细胞焦亡。此外，我们发现由于 LPS/ATP 的诱导，NRK-52E 细胞中 NLRP3 炎症小体和 NF- κ B κ B kappaB\kappa \mathrm{B} 信号通路的激活增加。NRK-52E 细胞中细胞焦亡的速率与 NLRP3 炎症小体和 NF- κ B κ B kappaB\kappa \mathrm{B} 信号通路的激活呈正相关。 这些数据表明，NF- κ B κ B kappa B\kappa B 信号通路和 NLRP3 炎症小体是 LPS/ATP 刺激的 NRK-52E 细胞发生焦亡的关键因素。
原癌基因 Mtdh 参与多种癌症的增殖、侵袭、转移和化学耐药等病理过程(El-Ashmawy 等, 2019; Shi 和 Wang, 2015; Wan 和 Kang, 2013)。最新研究表明，Mtdh 表达异常上调会促进糖尿病肾病中的炎症反应(Liu 等, 2019)和足细胞凋亡(Liu 等, 2016)，而沉默 Mtdh 可改善胸腺髓质上皮
细胞（Peng 等，2019a）。然而，Mtdh 在肾小管上皮细胞焦亡中的作用及其潜在机制尚未阐明。本研究中，LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞内 Mtdh 表达及 NF- κ B κ B kappaB\kappa \mathrm{B} 信号通路与 NLRP3 炎症小体的激活均显著增强。此外，Mtdh 下调可缓解 LPS/ATP 诱导的 NRK-52E 细胞焦亡。因此我们推测，Mtdh 可能通过激活 NF- κ B κ B kappaB\kappa \mathrm{B} 信号通路和 NLRP3 炎症小体参与 LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞焦亡过程。为验证该假说，我们采用 siRNA 瞬时转染 Mtdh。结果显示：当 Mtdh 被沉默时，LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞活力增强且焦亡减少。与此一致的是，我们发现 Mtdh 被阻断的细胞中 NF- κ B κ B kappaB\kappa \mathrm{B} 信号通路及 NLRP3 炎症小体激活受到显著抑制。 这表明 Mtdh 基因沉默通过抑制 NF- κ B κ B kappaB\kappa \mathrm{B} 信号通路，进而减少 NLRP3 炎症小体的激活，从而缓解了 LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞焦亡现象。在未经 LPS/ATP 处理的情况下，Mtdh 表达下调虽然抑制了 NLRP3 炎症小体激活和 p-p65 表达，但并未显著影响 NRK-52E 细胞的焦亡率，这可能是因为正常状态下 NRK-52E 细胞自发性焦亡效应较弱。Mtdh 表达下调提高了细胞活力，这可能是由于在未经 LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞中抑制了除焦亡以外的其他细胞死亡方式。
综上所述，我们的研究结果表明：Mtdh 表达下调通过抑制 NF- κ B κ B kappa B\kappa B 信号通路和 NLRP3 炎症小体激活，可缓解 LPS/ATP 处理的 NRK-52E 细胞焦亡。这些发现揭示了一个新的
肾小管上皮细胞焦亡机制，该机制可能成为治疗肾脏疾病的有效靶点。

数据可用性声明

数据可根据要求提供。

基金资助

本研究得到国家自然科学基金（项目编号：82100750）的资助。

利益冲突声明

作者声明，本文所述研究工作不存在任何可能被视为影响研究结果的财务利益冲突或个人关系。

参考文献

Boaru, S.G., Borkham-Kamphorst, E., Van de Leur, E., Lehnen, E., Liedtke, C., Weiskirchen, R., 2015. NLRP3 inflammasome expression is driven by NF-kappaß in cultured hepatocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 458, 700-706.

Chen, X., Liu, G., Yuan, Y., Wu, G., Wang, S. Yuan, L., 2019. NEK7 interacts with NLRP3 to modulate the pyroptosis in inflammatory bowel disease via NF-kappaB signaling. Cell Death Dis. 10, 906.

Chi, K., Geng, X., Liu, C., Cai, G., Hong, Q., 2020. Research progress on the role of Inflammasomes in kidney disease. Mediators Inflamm, 2020, 8032797.

El-Ashmawy, N.E., El-Zamarany, E.A., Khedr, E. G., Abo-Saif, M.A., 2019. Activation of EMT in colorectal cancer by MTDH/NF-kappaß p65 pathway. Mol. Cell Biochem. 457, 83-91.

El-Sisi, A.E.E., Sokar, S.S., Shebl, A.M., Mohamed, D.Z., Abu-Risha, S.E., 2021, Octreotide and melatonin alleviate inflammasome-induced pyroptosis through inhibition of TLR4-NF-kappaB-NLRP3 pathway in hepatic ischemia/reperfusion injury. Toxicol. Appl. Pharmacol. 410, 115340.

Hu, G., Wei, Y., Kang, Y., 2009. The multifaceted role of MTDH/AEG-1 in cancer progression. Clin. Cancer Res. 15, 5615-5620.

Jiang, C, Shi, R., Chen, B., Yan, X., Tang, G., 2020. Casticin elicits inflammasome- induced pyroptosis through activating PKR/JNK/NF-kappaß signal in 5-8F cells. Biomed. Pharmacother. 123, 109576.

Jo, E.K., Kim, J.K., Shin, D.M., Sasakawa, C., 2016. Molecular mechanisms regulating NLRP3 inflammasome activation. Cell. Mol. Immunol. 13, 148-159.

Kim, J.K., Jin, H.S., Suh, H.W., Jo, E.K., 2017. Negative regulators and their mechanisms in NLRP3 inflammasome activation and signaling. Immunol. Cell Biol. 95, 584-592.

Lee, S.G., Kang, D.C., DeSalle, R., Sarkar, D., Fisher, P.B., 2013. AEG-1/MTDH/LYRIC, the beginning: initial cloning, structure, expression profile, and regulation of expression. Adv. Cancer Res. 120, 1-38.

Li, X., Zeng, L., Cao, C., Lau, C., Lian, W., Han, J., Zhang, X., Zhang, J., Tang, T., Li, M., 2017. Long noncoding RNA MALATI regulates renal tubular epithelial pyroptosis by modulated miR-23e targeting of ELAVLI in diabetic nephropathy. Exp. Cell Res. 350, 327-335.

Li, Y., Yuan, Y., Huang, Z.X., Chen, H., Lan, R., Wang, Z., Lai, K., Chen, H., Chen, Z., Zou, Z., Ma, H.B, Lan, H.Y., Mak, T.W., Xu, Y., 2021. GSDME-mediated pyroptosis promotes inflammation and fibrosis in obstructive nephropathy. Cell Death Differ. 28, 2333-2350.

Lin, J., Cheng, A., Cheng, K., Deng, Q., Zhang, S., Lan, Z., Wang, W., Chen, J., 2020. New insights into the mechanisms of pyroptosis and implications for diabetic kidney disease. Int. J. Mol. Sci. 21.

Liu, W.T., Peng, F.F., Li, H.Y., Chen, X.W., Gong, W.Q., Chen, W.J., Chen, Y.H., Li, P.L, Ei, S.T., Xu, Z.Z, Long, H.B., 2016. Metadherin facilitates podocyte apoptosis in diabetic nephropathy. Cell Death Dis. 7, e2477.

Liu, Z., Gan, L., Xu, Y., Luo, D., Ren, Q., Wu, S., Sun, C., 2017. Melatonin alleviates inflammasome-induced pyroptosis through inhibiting NF-kappaB/GSDMD signal in mice adipose tissue. J. Pineal Res. 63.

Liu, B.C., Tang, T.T., Lv. LL., Lan. H.Y., 2018. Renal tubule injury: a driving force toward chronic kidney disease. Kidney Int. 93, 568-579.

Liu, W., Chen, X., Wang, Y., Chen, Y., Chen, S., Gong, W., Chen, T., Sun, L., Zheng, C.. Yin, B., Li, S., Luo, C., Huang, Q., Xiao, J., Xu, Z., Peng, F., Long, H., 2019. Micheliolide ameliorates diabetic kidney disease by inhibiting Mtdh-mediated renal Inflammation in type 2 diabetic db/db mice. Pharmacol. Res, 150, 104506.

Miao, N., Yin, F., Xie, H., Wang, Y., Xu, Y., Shen, Y., Xu, D., Yin, J., Wang, B., Zhou, Z., Cheng, Q., Chen, P., Xue, H., Zhou, L., Liu, J., Wang, X., Zhang, W., Lu, L., 2019. The cleavage of gasdermin D by caspase-11 promotes tubular epithelial cell pyroptosis and urinary IL-18 excretion in acute kidney injury. Kidney Int. 96, 1105-1120.

Peng, F., Li, H., Li, S., Wang, Y., Liu, W., Gong, W., Yin, B., Chen, S., Zhang, Y., Luo, C., Zhou, W., Chen, Y., Li, P., Huang, Q., Xu, Z., Long, H., 2019a. Micheliolide ameliorates renal fibrosis by suppressing the Mtdh/BMP/MAPK pathway. Lab. Invest. 99, 1092-1106.

Peng, Y., Li, H., Chen, D., 2019b. Silencing astrocyte elevated gene-1 attenuates lipopolysaccharide-induced inflammation and mucosal barrier injury in NCM460 cells by suppressing the activation of NLRP3 inflammasome. Cell Biol. Int. 43, 56-64.

Qiao, Y., Wang, P., Qi, J., Zhang, L., Gao, C., 2012. TLR-induced NF-kappaß activation regulates NLRP3 expression in murine macrophages. FEBS Lett. 586, 1022-1026.

Qing, Z., Ye, J., Wu, S., 2019. Lipopolysaccharide-induced expression of astrocyte elevated gene-1 promotes degeneration and inflammation of chondrocytes via activation of nuclear factor-kappaß signaling. Int. Immunopharmacol. 71, 84-92.

Rathinam, V.A.K., Zhao, Y., Shao, F., 2019, Innate immunity to intracellular LPS. Nat. Immunol. 20, 527-533.

Sarkar, D., Fisher, P.B., 2013, AEG-1/MTDH/LYRIC: clinical significance. Adv. Cancer Res, 120, 39-74.

Shao, X.F., Li, B., Shen, J., Wang, Q.F., Chen, S.S., Jiang, X.C., Qiang, D., 2020. Ghrelin alleviates traumatic brain injury-induced acute lung injury through pyroptosis/NF- kappaß pathway. Int. limmunopharmacol. 79, 106175.

Shi, X., Wang, X., 2015. The role of MTDH/AEG-1 in the progression of cancer. Int. J. Clin. Exp. Med. 8, 4795-4807.

Shi, J., Gao, W., Shao, F., 2017. Pyroptosis: gasdermin-mediated programmed necrotic cell death. Trends Biochem. Sci. 42, 245-254.

Song, Z., Zhang, Y., Gong, B., Xu, H., Hao, Z., Liang, C., 2019. Long noncoding RNA LINC00339 promotes renal tubular epithelial pyroptosis by regulating the miR-22- 3p/NLRP3 axis in calcium oxalate-induced kidney stone. J. Cell. Biochem. 120, 10452-10462.

Tian, L., Yan, J., Li K., Zhang, W., Lin, B., Lai, W., Bian, L., Liu, H., Xi, Z., Liu, X., 2021.. Ozone exposure promotes pyroprosis in rat lungs via the TLR2/4-NF-kappaB-NLRP3 signaling pathway. Toxicology 450, 152668.

Vande Walle, L., Lamkanfi, M., 2016. Pyroptosis. Curr. Biol. 26, R568-R572.

Wan, L., Kang, Y., 2013. Pleiotropic roles of AEG-1/MTDH/LYRIC in breast cancer. Adv. Cancer Res. 120, 113-134.

Wang, S., Lin, Y., Yuan, X., Li, F., Guo, L., Wu, B., 2018, REV-ERBalpha integrates colon clock with experimental colitis through regulation of NF-kappaB/NLRP3 axis. Nat. Commim. 9, 4246..

Wang, Y., Zhu, X., Yuan, S., Wen, S., Liu, X., Wang, C., Qu, Z., Li, J., Liu, H., Sun, L, Liu, F., 2019, TLR4/NF-kappaB signaling induces GSDMD-Related pyroptosis in tubular cells in diabetir: kidney disease. Front. Endocrinol. (Lausanne) 10, 603.

Wang, L., Zhang, N., Han, D., Su, P., Chen, B., Zhao, W., Liu, Y., Zhang, H., Hu, G., Yang, Q., 2021. MTDH promotes intestinal inflammation by positively regulating TLR signaling. J. Crohns Colitis.

Xu, Z., Liu, R., Huang, L., Xu, Y., Su, M., Chen, J., Geng, L., Xu, W., Gong, S., 2020. CD147 aggravated inflammatory bowel disease by triggering NF-kappaB-Mediated pyroptosis. Biomed Res. Int. 2020, 5341247.

Xue, Y., Enosi Tuipulotu, D., Tan, W.H., Kay, C., Man, S.M., 2019. Emerging activators and regulators of inflammasomes and pyroptosis. Trends Immunol. 40, 1035-1052.

Yang, J.R., Yao, F.H., Zhang, J.G., JI, Z.Y., Li, K.L., Zhan, J., Tong, Y.N., Lin, L.R., He, Y. N.. 2014, Ischemia-reperfusion induces renal tubule pyroptosis via the CHOP- caspase-11 pathway. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 306, F75-84.

Ye, Z., Zhang, L., LI, R., Dong, W., Liu, S., Li, Z., Liang, H., Wang, L., Shi, W., Malik, A.B., Cheng, K.T., Liang. X., 2019. Caspase-11 mediates pyroptosis of tubular epithelial cells and septic acute kidney Injury. Kidney Blood Press. Res. 44, 465-478.

Yi, H., Peng, R., Zhang, L.Y., Sun, Y., Peng, H.M., Liu, H.D., Yu, L.J., Li, A.L., Zhang, Y.J., Jiang, W.H., Zhang, Z., 2017. LincRNA-Gm4419 knockdown ameliorates NF- kappaB/NLRP3 inflammasome-mediated inflammation in diabetic nephropathy, Cell Death Dis. 8, 2583.

Yu, Z.W., Zhang, J., Li, X., Wang, Y., Fu, Y.H., Gao, X.Y., 2020. A new research hot spot: the role of NLRP3 inflammasome activation, a key step in pyroptosis, in diabetes and diabetic complications, Life Sci. 240, 117138.

Zhang, Z., Shao, X., Jiang, N., Mou, S., Gu, L., Li, S., Lin, Q., He, Y., Zhang, M., Zhou, W., Ni, Z., 2018. Caspase-11-mediated tubular epithelial pyroptosis underlies contrast- induced acute kidney injury. Cell Death Dis. 9, 983.

Zhang, K..J., Wu, Q., Jiang, S.M., Ding, L., Liu, C.X., Xu, M., Wang, Y., Zhou, Y., Li, L., 2021. Pyroptosis: a new frontier in kidney diseases. Oxid. Med. Cell. Longev, 2021, 6686617.

Zhao, J., Ma, W., Chen, W., Gao, J., Li, C., Tong, Y., Zhou, Q., Zhao, X., Wang, M... Xiao, H., Jin, Y., 2019. AEG-1 aggravates inflammation via promoting NALP3 inflammasome formation in murine endometriosis lesions. Anim Cells Syst (Seoul) 23, 407-413.


更新

《组织与细胞》

第76卷，2022年6月，页码

《脂多糖/三磷酸腺苷刺激的肾小管上皮细胞中 Metadherin 基因沉默可抑制细胞焦亡》更正声明[刊于《组织细胞》75 卷(2022 年)101722 号]

段秀萍 1 1 ^(1){ }^{1} ，宋雅珊 1 1 ^(1){ }^{1} ，李福记，廖蕴华*，刘文婷*广西医科大学第一附属医院肾内科，南宁 530022

表 1，si-NC 正义链序列（ 5 ′ − 3 ′ 5 ′ − 3 ′ 5^(')-3^(')5^{\prime}-3^{\prime} ）AGUUGUAAGUUGCUCGGUGTT。

应为。

UUCUCCGAACGUGUCACGUTT。
表 2，GAPDH 反向引物序列（ 5 ′ − 3 ′ 5 ′ − 3 ′ 5^(')-3^(')5^{\prime}-3^{\prime} ）
TCCGCCCCTTCCGCTGATG.

应为

CACGGAAGGCCATGCCAGTGA。

表 2，Mtdh 反向引物序列（ 5 ′ − 3 ′ 5 ′ − 3 ′ 5^(')-3^(')5^{\prime}-3^{\prime} ）
TCCCAGCAAACCTATCCACTCCTC.
应为
TCTTCAGTTGGGCTGGGTCCTC.
图 3G
FITC 与 PI 双阳性细胞比例
应为
FITC 与 PI 双阳性细胞比例(%)
2.1. 细胞培养及 LPS/ATP 处理
细胞培养采用高糖达尔伯克改良伊格尔培养基
（DMEM，普诺赛生命科学技术有限公司），培养基中添加 5%胎牛血清（Gibco，美国纽约格兰德岛）和 10 % 10 % 10%10 \% 青霉素（Solarbio，中国北京），置于恒温培养箱（ 37 ∘ C , 5 % CO 2 37 ∘ C , 5 % CO 2 37^(@)C,5%CO_(2)37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} ）中饱和湿度条件下培养。
应为
细胞培养于含 5%胎牛血清（Gibco，美国纽约州格兰德岛）和 1 % 1 % 1%1 \% 青霉素（Solarbio，中国北京）的高糖杜氏改良伊格尔培养基（DMEM，Procell 生命科学技术有限公司）中，置于恒温培养箱（ 37 ∘ C , 5 % CO 2 37 ∘ C , 5 % CO 2 37^(@)C,5%CO_(2)37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} ）内饱和湿度条件下培养。
2.2 细胞转染
随后，将 5 × 5 × 5xx5 \times 转染缓冲液稀释至 1 × 1 × 1xx1 \times 后取 100 μ L 100 μ L 100 muL100 \mu \mathrm{~L} ，加入 0.4 μ L 0.4 μ L 0.4 muL0.4 \mu \mathrm{~L} 的 siRNA ( 20 μ M ) ( 20 μ M ) (20 muM)(20 \mu \mathrm{M}) 与 2.6 μ L 2.6 μ L 2.6 muL2.6 \mu \mathrm{~L} 的 PepMute 试剂混合。
应
接下来，将 20 μ L 20 μ L 20 muL20 \mu \mathrm{~L} 的 5 × 5 × 5xx5 \times 转染缓冲液稀释至 1 × 1 × 1xx1 \times 后，取 0.4 μ L μ L muL\mu \mathrm{L} 的 siRNA（ 20 μ M 20 μ M 20 muM20 \mu \mathrm{M} ）与 2.6 μ L 2.6 μ L 2.6 muL2.6 \mu \mathrm{~L} 的 PepMute TM TM ^(TM){ }^{\mathrm{TM}} 试剂混合。
作者对可能造成的不便深表歉意。
  1. 缩写说明：ASC，含半胱天冬酶-1 募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白；ATP，三磷酸腺苷；CCK8，细胞计数试剂盒-8；DMEM，杜尔贝科改良伊格尔培养基；FITC，异硫氰酸荧光素；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；GSDMD，消皮素 D；IL，白细胞介素；LPS，脂多糖；Mtdh，metadherin 蛋白；NC，阴性对照；NF-кB，核因子κB；PI，碘化丙啶；RT-qPCR，逆转录实时定量聚合酶链反应；si-Mtdh Mtdh，小干扰 RNA；siRNA，小干扰 RNA。
    • 通讯作者。
    电子邮箱地址：yunhualiao1962@163.com（廖蕴华），tingwenliu1@163.com（刘文婷）。
    1 1 ^(1){ }^{1} 共同第一作者：两位作者贡献均等。
    • 通讯作者。
    电子邮箱地址：yunhualiao1962@163.com（廖蕴华），tingwenliu1@163.com（刘文婷）。
    1 1 ^(1){ }^{1} 共同第一作者：各位作者贡献均等