低甲基化触发的 SERPINE1 （Serpin Family E 成员 1） 加剧了昼夜节律紊乱诱导的高雄激素血症的多囊卵巢综合征

2.1. 连续黑暗暴露的大鼠模型进化出 PCOS 样表型

我们以前的研究表明，大鼠黑暗暴露于 8 周会导致 PCOS 样表型，包括高雄激素血症、发情周期紊乱和多囊卵巢 [ 11 ， 12 ]，这促使我们研究个体表型何时出现以及它们如何动态变化。

为了阐明连续黑暗模型的纵向变化，在适应 1 周后，将 6 周龄雌性 SD 大鼠随机分为两组：对照组，暴露于正常的 12：12 h 光照-黑暗循环，黑暗组，暴露于连续黑暗。在第 0 、 2、 4、 6 和 8 周，处死大鼠进行观察和取样 （图 1A ）。在 8 周期间，未观察到他们的卵巢质量或体重发生变化（图  1B,C ）。接下来，评估生殖内分泌改变的出现。正如预期的那样，深色组在 PCOS 诊断标准中表现出主要表型，包括不规则的发情周期（图 1D ）、多囊卵巢（图  1E ）和高雄激素血症（图  1F ）。 值得注意的是，深色组的睾酮水平以时间依赖性方式增加，第 6 周有显着差异，第 8 周进一步增加（图  1F ）。尽管在 8 周内的任何时候性激素结合球蛋白 （SHBG） 水平都没有显着变化（图  1G ），但假设在黑暗中第 2 周和第 8 周的游离雄激素指数 （FAI） 高于对照组（图  1H ）。此外，黄体生成素 （LH） 水平在第 6 周和第 8 周显着增加，而促卵泡激素 （FSH） 水平保持不变，LH/FSH 比率显着增加（图  1I–K ）。深色组在第 8 周时也表现出炎症和脂质代谢受损（图 S1 ）。 这些发现表明，长时间暴露在黑暗中的大鼠的表型出现在不同的时间点，这意味着存在控制急性反应和慢性适应的各种表观遗传调控机制。

2.2. 持续的黑暗暴露导致卵巢 GC 的动态甲基组学和转录组学谱发生变化

为了确定在连续黑暗的不同时间点负责动态表型的表观遗传调控机制，SureSelectXT 大鼠 DNA 甲基化靶标捕获的亚硫酸氢盐测序 （MC-seq;采用 Agilent Technologies， CA， USA），并检查了在跨越 8 周的五个时间点收集的大鼠卵巢 GCs 的 DNA 甲基化（图 1A ）。全基因组 DNA 甲基化谱表明，15-85% 的测试的 CpG 位点被甲基化（二项式测试， q 值 < 0.05），与以前的发现一致 [ 21 ]。随着时间的推移，整体 DNA 甲基化仅显示出轻微的总体变化（图  2A ）。随后，将每组标准化 DNA 甲基化数据与包括促进/转录起点 （TSS） 和转录终点的基因模型进行比对。10 组的甲基化模式是同源的。并且在 TSS 上游 1 kb 的甲基化水平急剧下降，随后是 TSS 上游的最低点和整个基因体区域的高甲基化水平（图  2B 和 S2A,B ）。这表明 DNA 甲基化谱通常是纵向稳定的，并且 8 周的连续黑暗暴露不会对 DNA 甲基化造成显着干扰。

为了确定纵向甲基化谱的动态模式，我们专注于通过短时间序列表达矿工 （STEM） 分析来检查基因启动子区域的甲基化水平。结果表明暗组中有四个聚类模块 （p < 0.05） （图  2C ）。第一个模块随着时间的推移逐渐低甲基化，其表现出与 PCOS 患者 [ 13 ] 和夜班工作的人相似的甲基化特征 [ 22 ]。随后，我们进行了基因本体论 （GO） 富集、京都基因与基因组百科全书 （KEGG） 和反应组通路分析，以预测具有低甲基化趋势的该模块的功能和通路概况。这些基因主要富集于免疫炎症以及 AKT 和代谢途径 （图  2D ）。STRING 蛋白相互作用网络 （ http://string‐db.org/ ） 表明，持续低甲基化基因主要富集在免疫系统中，包括抗原呈递、泛素化修饰和炎症因子（图 S2C–G ）。为了研究差异甲基化 位点 （DMS） 与每种表型之间的关联，进行了加权相关网络分析，获得了与睾酮、 FAI、LH、瘦素和白细胞介素 1 β （IL-1b） 表现出显著和负关联的三个模块 （MEdarkorange、MEgrey60 和 MEblack）。此外，KEGG 分析揭示了富含代谢相关通路的模块内的差异表达基因 （DEG）（图 S2H–J ）。这些数据表明，黑暗引起的变化富含神经、代谢和炎症途径。

尽管所有时间点甲基化位点的平均差异很小，但在每对暗组和对照组之间鉴定出 386-511 个差异甲基化区域 （DMR） 和 80,926-86,927 个 DMS（图 S3A,B ）。这些可能是驱动疾病表型的关键。动态火山图显示第 6 周时 DMS 显着增加，深色组中低甲基化位点显着升高（图  2E ）。值得注意的是，在第 6 周仍观察到启动子 TSS 区域中最高的 DMR 和 DMS 数量（图 S3C,D ）。我们在此展示了基因 Igf2r 和 timeless 的 TSS 区域中 CpG 位点随时间变化的变化。尽管甲基化变化因基因而异，但它们的差异在第 6 周时扩大（图 S3E,F ）。主成分分析揭示了类似的现象，即根据 CpG 位点甲基化，大鼠在第 6 周的聚集效果更好（图  2F ）。由于最显着的甲基化变化发生在第 6 周，因此此时研究进行性改变诱导的表达变化将非常有趣。

我们在连续黑暗中重塑大鼠 6 周，从卵巢 GCs 中提取 RNA 用于 RNA 测序。与对照组相比，深色组体重相似（图 S4A ），睾酮水平（图 S4B ）、卵巢组织学切片（图 S4C ）和葡萄糖代谢（图 S4D,E ）明显异常。在暗组和对照组之间共鉴定出 378 个 DEGs，分别包括 90 个和 288 个上调和下调的基因（图  2G ）。DEGs 的功能富集和聚类分析揭示了与脂质代谢和神经通路相关的术语的富集（图  2H ）。这一发现与 6 周黑暗暴露诱导的 DNA 甲基化变化的富集分析结果一致（图  2I–K ）。

2.3. 黑暗诱导的 Serpine1 CpGs TSS 附近的低甲基化与血清睾酮水平高度相关

为了进一步探索这种表观遗传修饰与 6 周黑暗暴露诱导的表达变化之间的关联，我们对 2818 个 DEGs 和 4272 个启动子 DMS 进行了综合分析。值得注意的是，在四个象限中，象限 II 显示 108 个基因启动子 CpG 甲基化降低和表达较高（图 3A ）。在象限 II 的基因和 STEM-D1 中持续低甲基化的基因之间进行维恩分析，鉴定出 16 个重叠的基因。这些基因在 6 周的黑暗暴露期间保持持续的低甲基化水平，同时过表达（图  3B ）。值得注意的是，编码分泌蛋白并与炎症和脂质代谢有明显关联的四个候选基因 Serpine1 [ 17 ]、Lep [ 23 ]、IL-2 [ 24 ] 和 Agt [ 25 ]聚集在 STRING 网络中（图  3C ）。热图显示，随着时间的推移，这四个基因的启动子区甲基化逐渐降低（图  3D ）。有趣的是，在 Serpine1 的启动子区甲基化与血清睾酮和 FAI 之间观察到显著负相关（图  3E ），表明 Serpine1 甲基化与雄激素之间存在潜在关联。这些发现表明，低甲基化导致 Serpine1 过表达，因此导致高雄激素血症。

几项研究报道了 DNA 甲基化与基因转录水平之间的负相关 SERPINE1 26 [ ]。 然而，缺乏对可诱导转录变化的特异性 Serpine1 CpG 的研究。我们通过 qPCR 验证了 Serpine1 在 GCs 中超过 8 周的过表达（图  3F ）。此外，我们通过焦磷酸测序证实了在 MC-seq 和附近 CpG 中观察到的 CpG（位置 2）从 Serpine1 启动子区域（图  3G,O ），然后通过 ELISA 血清 PAI-1 水平逐渐升高（图  3H ）。这一发现在肝脏（图  3I,J ）、参与 Serpine1 合成的主要器官 [ 27 ] 以及脂肪组织（图 S5A ）和棕色脂肪组织（图 S5B ）中也得到了证实。这些数据表明，低甲基化和高 Serpine1 表达是普遍的黑暗诱导现象，表明 DNA 甲基化在 Serpine1 表达的调节中起关键作用。

为了进一步验证这种基于甲基化修饰开关的基因激活，我们用 5-Aza-2'-脱氧胞苷 （5-Aza） 处理人 KGN 细胞系细胞，5-Aza-2'-脱氧胞苷是一种与 DNA 结合并抑制 DNMT 活性和表达的 DNA 甲基转移酶抑制剂 [ 27 ]。qPCR 和 Western blotting 显示 5-Aza 以剂量和时间依赖性方式促进 SERPINE1 表达（ 图   3K ， L ）。在原代大鼠 GC 中观察到类似的结果（图  3M,N 和 S5C ）。

接下来，我们使用靶向 DNA 甲基化编辑工具 dCas9-Dnmt3aCD 对特定 CpG 位点的表观遗传改变进行推断因果关系。特异性向导 RNA （sgRNA） 被设计用于将 dCas9-DNMT3aCD 系统带到位于 Serpine1 第一个外显子的 TSS 附近的序列，包括大鼠正常肝细胞系 BRL-3A 中的位置 1、2 和 3（图  3O 和 S5D ）。焦磷酸测序显示，dCas9-Dnmt3aCD/gRNA 转导显著增加了 1、2 和 3 位以及相邻位 4 的 DNA 甲基化，但在远处的 7 和 8 位没有增加（图  3P ）。长散布核元件 1 的 DNA 甲基化反映了细胞中的整体 DNA 甲基化，在 sgRNA 处理和对照之间没有显着差异（图  3Q ）。染色质免疫沉淀结果还验证了 DNMT3A 蛋白与靶启动子区域的特异性结合（图 S5E ）。这些结果表明成功的靶向甲基化。随后，qPCR 结果显示靶向甲基化细胞中的 Serpine1 转录本显著减少（图  3R ）。这些结果表明，Serpine1 表达通过 TSS 附近的甲基化有效降低。

2.4. SERPINE1 抑制芳香化酶表达并通过 PI3K/AKT 通路促进雄激素积累

由于多组学测序结果表明 Serpine1 和睾酮之间存在潜在相关性，因此我们对血清 SERPINE1 （PAI-1） 和睾酮进行了 Pearson 分析，发现存在显著的正相关（图  4A ）。

因此，研究 SERPINE1 在 GCs 雄激素代谢途径中的功能很有价值。首先，我们通过检测添加雄激素后细胞上清液中的雌激素水平来间接测定芳香化酶活性，发现在 KGN 或原代大鼠 GC 中敲低后 SERPINE1 过表达后芳香化酶活性显着降低，反之亦然（图 4B,C ）。其次，我们检查了参与雄激素代谢途径的几种关键酶的表达。CYP19A1 过表达后 SERPINE1 表达显著降低，敲低后反之亦然（图  4D–K 和 S6 ）。第三，我们使用活性测定试剂盒直接检测芳香化酶活性，结果与间接法一致（图  4L,M ）。使用免疫荧光，我们验证了 SERPINE1 抑制了 CYP19A1 表达，并确定了 SERPINE1 主要位于细胞质和细胞外基质中;相反，芳香化酶分布在细胞核和细胞质中，而芳香化酶分布在细胞质中（图  4N,O ）。因此，我们假设细胞质和细胞外基质中的 SERPINE1 可能通过特定的信号通路传递抑制信号，从而抑制 CYP19A1 转录和表达。

为了进一步验证这一假设，我们用两种 SERPINE1 抑制剂 Loureirin B （LrB） 和 tiplaxtinin （TPX） 干扰 KGN 细胞。qPCR 结果表明，LrB 处理 72 小时后 CYP19A1 表达急剧增加 10 倍（图  5A ）或 TPX 增加 3 倍（图  5B ）。Western blotting 结果支持这种现象，PAI-1 水平降低，芳香化酶表达在 72 小时突然激增（图  5C,D ）。细胞计数试剂盒 8 实验表明，在此过程中，抑制剂对细胞增殖没有影响（图 S7A ）。然后，我们使用 Phospho Explorer 抗体微阵列 （PEX100） 分析 TPX 处理 0 分钟和 15 分钟时的信号通路蛋白变化。差异磷酸化蛋白根据以下途径分为三个簇：AKT、Ras 和 MAPK（图  5E ）。我们使用蛋白质相互作用网络 （PPI） 网络和 Metascape 来识别蛋白质相互作用，并使用 Cytoscape 来可视化它们（图  5F ）。来自高程度蛋白和前五条通路的功能富集分析显示，AKT1 具有高度的蛋白质相互作用，而 PI3K/AKT 通路具有最多的相互作用蛋白（图  5G ）。同时，差异磷酸化蛋白的 KEGG 和通路图谱显示显着的 PI3K/AKT 通路富集（图  5H,I 和 S7B ）。为了进一步确认，我们进行了蛋白质印迹，发现 AKT 在 TPX 处理 15 分钟后被显着磷酸化（图 S7C ）。 当加入两种不同的抑制剂 72 小时时，磷酸化的 AKT 显示出相似的模式，在前 48 小时内增加，然后减少（图  5J,K 和 S8 ）。这些发现表明，PI3K/AKT 在 SERPINE1 水平升高引起的芳香化酶下调中起关键作用。

2.5. TPX 有效改善大鼠脱氢表雄酮引起的疾病和持续黑暗

由于我们之前观察到 SERPINE1 抑制后的低雄激素作用，因此我们在临床前研究中研究了 SERPINE1 抑制剂的治疗潜力。我们首先在脱氢表雄酮 （DHEA） 建模期间测试了不同浓度的 TPX 或 LrB 同时管饲 21 天的效果（图 6A 和 S9A ）。与对照组相比，DHEA 处理的大鼠表现出排卵受损，表现为卵泡大多在窦前卵泡期阻塞以及发情周期停滞和紊乱。值得注意的是，TPX 2 mg/kg，而不是 TPX 20 mg/kg 或 LrB，有效地减少了窦前卵泡的数量，增加了黄体的数量并恢复了正常 周期（图  6B,C 和 S9B ）。TPX 治疗有效抑制了 PAI-1 水平（图  6D ），并在没有显着 SHBG 和促性腺激素波动的情况下恢复了 DHEA 治疗大鼠的异常睾酮和 FAI 水平（图  6E–J ）。值得注意的是，在 DHEA 治疗组中，PAI-1 水平没有显着降低，导致推测 SERPINE1 可能是体内雄激素水平升高的上限刺激，而不是反应（图  6D ）。与高雄激素水平一致，TPX 的芳香酶促进作用诱导 E2 水平略有增加（图  6K ）。此外，大鼠的体重随着 TPX 2 mg/kg 而降低（图  6L 和 S9C ）。IPGTT 结果表明，在任何剂量下，TPX 2 和 20 mg/kg 的葡萄糖代谢效应明显比 LrB 更有效（图  6M 和 S9D,E ）。这些发现表明 PAI-1 在高雄激素血症诱导的 PCOS 中起治疗作用。

接下来，我们在 8 周的连续黑暗暴露期间通过管饲法对大鼠进行连续 TPX 治疗（图 6N ）。与以前的发现一致，正如之前观察到的那样，深色组表现出卵巢形态、发情周期和 PAI-1 水平升高的表现（图  6O–Q ）。TPX 显着降低 PAI-1 水平和雄激素水平 （图  6Q–T ），进一步验证了 SERPINE1 对体内雄激素的下调作用。正如预期的那样，TPX 显着逆转了深色组的 LH 水平升高，但 TPX 治疗后 FSH 水平下降 （图  6U–W ），表明 TPX 对促性腺激素分泌具有潜在的抑制作用。有趣的是，与 DHEA 模型相反，我们没有观察到类似的 E2 水平积累（图  6X ）。虽然大鼠的体重没有变化（图  6Y ），但 TPX 治疗部分挽救了黑暗诱导的葡萄糖代谢异常（图  6Z ）。这些结果表明 PAI-1 在昼夜节律破坏诱导的高雄激素血症中的治疗作用。

2.6. SERPINE1 在 PCOS 女性患者中低甲基化和过表达

为了确定我们在大鼠中的 PCOS 发现是否可能与人类的 PCOS 发现相关，我们首先确认了 57 名 PCOS 女性和 57 名对照者的队列中的血清 PAI-1 水平。结果，PCOS 患者的 PAI-1 水平显着升高（ 图   7A 和表 S1 ）。此外，我们表征了该队列中血清 PAI-1 和睾酮水平之间的显着正相关（图  7B ）。PAI-1 也与 BMI 和 HOMA-IR 有很强的相关性（图 S10A,B ），如以前的文献所述 [ 28 ， 29 ]。但我们发现 PCOS 患者和对照组滤泡液中的 PAI-1 没有差异（图 S10C 和表 S2 ）。与大鼠 GC 的数据一致，PCOS 患者外周 白细胞中 SERPINE1 启动子中 CpG 的甲基化水平降低（图  7C,D 和表 S3 ）。值得注意的是，两个发生显著变化的 CpG 位点（位置 10 和 11）位于靠近 TSS 的启动子区域，这与在大鼠中观察到的变化非常相似。

4.1. 动物使用和护理

动物研究方案得到了上海模式生物中心动物伦理委员会 （2021‐0011‐01） 和上海中医药大学 （PZSHUTCM211101047） 的批准。所有动物实验均按照当地动物伦理委员会的指导方针进行。

4.2. 连续黑暗暴露大鼠模型

如前所述生成了连续黑暗暴露的 SD 大鼠模型 [ 11 ， 12 ]。在 12：12 h 光-暗循环适应 1 周后，共使用 80 只雌性 SD 大鼠 （5-6 周）。将大鼠随机分为两组：（1） 深色组，用不透水的黑色笼布笼住，导致连续的黑暗环境和 （2） 对照组，保持在 12：12 h 的光照-黑暗循环下。每组 8 只大鼠每 2 周处死 8 只，共 8 周。

4.3. DHEA 治疗

未成熟 （21 d 龄） 雌性 SD 大鼠每天注射 DHEA （60 mg ^kg-1/d，溶于 0.2 mL 芝麻油，D4000;Sigma Aldrich， St. Louis， USA）皮下注射，作为 DHEA 组。对照组每天注射相同体积的芝麻油。上述动物均治疗 3 周。

4.4. TPX 处理

TPX 通过管饲法作为抢救治疗给药。对于黑暗处理的模型，有三组：（1） 黑暗 + TPX，在连续黑暗环境中保存并用 TPX（2 mg ^kg-1/d，用 1% DMSO 玉米油稀释，HY-15253;MedChemExpress，美国新 泽西州），（2） 深色 + 油，在连续黑暗环境中保存并用玉米油管饲（HY-Y1888;MedChemExpress），（3） 对照 + 油，保持在 12：12 小时的光-暗循环下，并用玉米油管饲。上述动物均治疗 8 周。对于 DHEA 处理的模型，有三组：（1） DHEA + TPX，注射 DHEA （60 mg ^kg-1/d） 并用 TPX （2 mg ^kg-1/d） 灌胃，（2） DHEA + 油，注射 DHEA （60 mg ^kg-1/d） 并用玉米油灌饲，（3） 油 + 油， 注入芝麻油，用玉米油灌胃。上述动物均治疗 3 周。

4.5. MC-seq DNA 甲基化数据分析

对于 MC-seq，通过碱基鉴定和错误过滤鉴定测序获得的原始图像文件，以获得可用于分析的原始测序片段，并将结果以 FASTQ 文件格式存储。使用 FastQC （ver. 0.11.5） 检查序列数据质量。Trim_galore （ver. 0.4.1） 去除了质量分数低的碱基和所有测序 reads 中的接头。修剪的读数通过 Bismark 管道（版本 v0.15.0;bowtie v2.2.9）映射到 Rattus norregicus 基因组（RAT6.0，集合）。deduplicate_bismark 删除了重复的 reads。保留所有覆盖深度为 ≥10× 的 CpG 位点进行分析，以确保高 MC-Seq 数据质量。每个样品在测序后提供约 20 G 的原始数据，目标捕获区域约为 90 Mb。目标读取率从 71.27 到 84.26% 不等，阈值设置为：p < 0.05，甲基化差异度 >10%。DMR 通过 R 包 DSS 调用 DMR 函数获得，DMR 长度（小于 1000 bp）和 CpG 数（DMR 中至少 3 CpGs），阈值设置为：成对卡方检验，随后进行多次检验校正;调整后 p < 0.05，最小差异截断值为 10%。启动子区域定义为 tTSS 的 −2.5 至 +0.5 kb 区域。使用 KOBAS-i （KOBAS 3.0） 将选定的 DMS 相关基因映射到 GO 数据库、KEGG 数据库和 Reactome 数据库中的每个术语，并计算每个术语中的基因数量。Fisher 精确检验用于测量注释术语中的基因富集。使用 R （v.3.3.1） 进行主成分分析。

4.6. RNA-seq 数据分析

使用 Seqtk （GitHub—lh3/seqtk： Toolkit for processing sequences in FASTA/Q formats） 对原始双端 RNA-seq FASTQ 数据进行修剪，以去除衔接子序列和低质量碱基。使用 Hisat2 （版本：2.0.4） 将修剪的读数定位到 Rattus norregicus 基因组 （RAT6.0， ensemble）。通过 Stringtie （版本：1.3.0） 和 TMM （M 值的修剪平均值） 计算每个基因的表达水平为每千碱基外显子模型每百万映射读数 （FPKM） 的片段数。使用 edgeR 进行 DEGs 分析。DEG 如下：至少 1.5 倍的变化和调整后的 p 值（通过 Wald 检验获得，并默认使用 Benjamini-Hochberg 方法对多次测试进行校正）小于 0.05。将 DEG 提交到 DAVID 6.8 网站进行 KEGG 分析，并使用 Fisher 精确检验来测量基因富集。

4.7. 甲基化和转录的相关性分析

为了获得差异甲基化和基因表达之间的相关性，我们只考虑了启动子区域中的 DMS。我们绘制了 log2 倍表达变化与甲基化差异的关系，并使用 Fisher 精确检验测试基因在四个结果象限中的分布的方向性。

4.8. BRL-3A 细胞中基于 CRISPR-dCas9 的靶向甲基化

sgRNA-ZsGreen1-T2A-Puro （PGMLV-SpCas9） 载体 （GM-8199） 和 GPLVX-CMV-3×Flag-NLS-dCas9-Dnmt3aCD-T2A-杀稻瘟菌素载体 （10948） 购自 Genomeditech（中国上海）。为了生成具有整合 dCas9-Dnmt3a 转基因的稳定细胞系，将 BRL-3A 细胞接种到六孔板中，并于第二天以 30-50% 汇合度转染。我们将 5 μg/mL 聚凝胺 （Sigma-Aldrich） 添加到 10% FBS DMEM 中。根据提供者的方案，用 GPLVX-CMV-3×Flag-NLS-dCas9-Dnmt3aCD-T2A-杀稻瘟菌素的慢病毒颗粒转导 BRL-3A 细胞。用杀稻瘟菌素 S （25 μg/mL，GM-040404;Genomeditech） 48 小时。然后用不同 sgRNA-ZsGreen1-T2A-Puro 载体的慢病毒颗粒分别转导稳定的 dCas9-Dnmt3aCD-BRL-3A 细胞（表 S4 ）。用嘌呤霉素 （1.5 μg/mL，GM-040401;Genomeditech 的 Genomeditech）。在本研究中，感染后 3 天收获细胞。

4.9. 磷酸化抗体阵列分析

使用 KGN 细胞通过 Wayen Biotechnologies（中国上海）的磷酸化抗体阵列 （Full Moon， Sunnyvale， USA） 和 phospho‐Exploerer （PEX100） 分析，鉴定 PAI-1 靶向蛋白。用 TPX （10 μM） 处理 KGN 细胞 15 分钟，然后收集细胞用于阵列。磷酸化信号比值计算如下：磷酸化比值 = 磷酸化/非磷酸化。15 和 0 min 之间的磷酸化比值计算如下：磷酸化比值 = 磷酸化比值 （15 min）/磷酸化比值 （0 min）。将 Fold Change 阈值设置为 1.5 以获得差异磷酸化蛋白。

4.10. 临床样本

本研究纳入了 2015 年 1 月至 2017 年 12 月在上海交通大学医学院附属任济医院生殖医学科接受体外受精胚胎移植治疗的患者。收集患者丢弃的血清、血浆和卵泡液用于研究。上海交通大学医学院附属任济医院医学伦理委员会批准了该研究过程（第 2017041411 号），所有参与者均提供了书面知情同意书。PCOS 诊断标准的主要参考是 2003 年修订的 PCOS 鹿特丹共识。基本变量和与 PCOS 相关的人体测量变量见表 S1–S3 。

4.11. 统计分析

所有数据均以 SD ±平均值表示。每个实验/组使用 3-5 个样品/独立重复。使用 IBM SPSS Statistics 和 GraphPad Prism 8 （GraphPad Software） 进行统计分析。使用 Levene 方差相等性检验分析统计显着性。两组之间的差异由双尾 Student's t 检验确定，其中数据是正态分布的数据。两组以上之间的差异通过单因素方差分析后跟 Dunnett 事后检验或 Kruskal-Wallis 检验后跟 Dunn 事后检验确定。当假设相等方差时，使用 Pearson 相关系数分析两个数据集之间的相关性。p < 0.05 被认为具有统计学意义。