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第一部分：盆腔放疗的临床方面及放射性盆腔炎症

1.1 盆腔放疗的解剖靶区

1.2 放射性骨盆炎症涉及的组织

• 胃肠道：小肠和大肠均可能受损。小肠黏膜损伤引起放射性肠炎，而直肠/结肠损伤则导致放射性直肠炎/结肠炎。临床上，如果多个肠段受到照射，患者常表现为混合型病变3。
• 膀胱及尿路：放射性膀胱炎是骨盆放疗的常见后果，尤其见于前列腺癌或宫颈癌患者。部分患者可发生慢性膀胱炎（出血性膀胱炎）4。
• 生殖道：女性盆腔放射治疗可能影响阴道和子宫（阴道狭窄、卵巢功能衰竭），男性则可能影响勃起功能（放射性直肠炎及周围神经）。 （然而，这些通常不被描述为与肠道或膀胱相同意义上的“炎症”。）
• 盆腔血管和神经：放射线可引起闭塞性动脉炎（血管纤维化）和神经病变，但其表现为缺血和纤维化，而非典型炎症3
  5 .

1.3 放疗后典型疾病及其发生率

• 放射性肠炎/结肠炎/直肠炎——小肠和/或大肠黏膜的炎症和损伤。患者可能出现腹泻、腹痛、出血、吸收不良、狭窄、瘘管和慢性溃疡。这些是盆腔放疗的典型胃肠道并发症。
• 放射性膀胱炎——膀胱炎症，导致排尿困难、尿频、尿急，甚至可能出现出血性膀胱炎（尿中带血）。此病症发生于少数患者，但一旦出现，可能较为严重。
• 盆腔瘘管和狭窄——慢性放射线照射可导致纤维化，进而引起肠道或膀胱的狭窄（狭窄症），或肠道与其他结构之间的异常连接（瘘管），例如直肠阴道瘘。
• 继发恶性肿瘤——长期来看，患者在照射区域内发生第二次癌症的风险虽小但有所增加（例如放射相关的结直肠癌或膀胱癌）6。
• 其他晚期效应——包括盆骨骨折（盆骨功能不全性骨折）、阴道狭窄、性功能障碍和淋巴水肿。

1.4 放射性直肠结肠炎的当前研究

• 机制研究：新的证据挑战了早期认为晚期放射性肠损伤纯粹是缺血/纤维化的观点。例如，2023年一项对盆腔放疗后2-20年直肠活检的研究发现“肠黏膜存在慢性、低度炎症”，伴有中性粒细胞增多、黏液屏障受损及细菌易位 ${}^{11}$${}^{11}$^(11){ }^{11} 。这表明即使数十年后，受照射的肠道仍存在持续的炎症变化。其他研究强调肠道微生物群的关键作用：放疗导致菌群失调（如乳酸杆菌和双歧杆菌减少，病原体过度生长），从而持续炎症和屏障功能障碍12 13。总之，当前研究正在探讨放射线如何诱导自我维持的炎症状态和屏障破坏。
  结肠，以及如何通过针对微生物组的治疗或抗炎剂来缓解这一问题。
• 干预试验：临床上，针对慢性放射性直肠炎已测试了多种干预措施。最近的一项系统评价发现了口服治疗的随机试验（硫糖铝、高剂量维生素 A、丁酸盐、潘托昔林、中药方剂、高纤维饮食等）89。例如，三项安慰剂对照的口服硫糖铝试验显示其疗效无显著优于安慰剂 8，而几项传统中医或棕榈酸视黄酯的试验报告了症状改善（如出血减少） ${}^9$${}^9$^(9){ }^{9} 。然而，整体证据质量较低（试验规模小，终点异质性大）。高压氧治疗、局部硫糖铝灌肠及其他措施也曾被研究，但缺乏有力的大型随机对照试验数据。
• 新兴的临床前模型：为了改善转化研究，研究人员正在开发慢性放射性肠炎/直肠炎的小鼠模型。例如，最近有一组报道了一种使用分次 X 射线（例如 $10\mathrm{Gy}\times 4$$10\mathrm{Gy}\times 4$10Gyxx410 \mathrm{~Gy} \times 4 天）的小鼠盆腔放射模型，该模型在 $\sim 6$$\sim 6$∼6\sim 6 周时产生了慢性结肠损伤（隐窝丧失、炎症） ${}^{14}$${}^{14}$^(14){ }^{14} 。此类模型使得生物标志物和干预措施的研究成为可能（例如，他们鉴定了粪便乳铁蛋白和弹性蛋白酶作为无创标志物）15。

1.5 盆腔肿瘤的局部放疗与全腹放疗

1.6 区分急性与慢性放射性肠炎的标准

• 急性放射性肠炎：症状出现在放疗期间或放疗结束后约2-3个月内16 17。病理上，急性损伤以上皮细胞凋亡、黏膜炎症和水肿为特征。临床上通常表现为腹泻、
  痉挛、恶心或里急后重，通常在治疗结束后的几周内达到高峰。大多数急性症状在放疗结束后数周至数月内缓解。
• 慢性（或延迟性）放射性肠炎：症状在数月到数年后出现。通常，慢性肠炎/直肠炎被定义为放疗后 $\ge 6$$\ge 6$>= 6\geq 6 个月（通常为 $\ge 3$$\ge 3$>= 3\geq 3 个月）出现的新发或持续症状16 17。慢性损伤涉及进行性纤维闭塞性变化：黏膜下纤维化、闭塞性动脉炎和肠壁增厚。患者可能出现狭窄、瘘管或缺血性溃疡。在一项专家综述中，慢性盆腔放射病被认为在 $\sim 6$$\sim 6$∼6\sim 6 个月至数年后出现，且症状随时间加重18。简言之，急性与慢性的分界大约为2-3个月：3个月内的不良反应为“急性”，超过此时间（尤其超过6个月）为“慢性”1617。

1.7 小鼠慢性肠炎的评估标准、症状及时间线

• 时间线：腹部/盆腔照射后，小鼠在数日内表现出急性胃肠综合征。一项综述指出，放射引起的胃肠损伤在照射后 4-10 天内在小鼠中出现，最严重的症状约在第 6 天出现 1920。受影响的小鼠出现稀便或腹泻，表现为嗜睡、驼背，并显著体重下降 1920。约在 $2-4$$2-4$2-42-4 周时，幸存者通常恢复并趋于稳定。相比之下，慢性变化则在更晚时间点进行研究。实际上，许多研究团队将“慢性”定义为照射后 4-6 周持续存在的效应。例如，Grimaldi 等（2023）在 $4\times 10$$4\times 10$4xx104 \times 10 Gy 方案照射后 38 天观察结肠组织以界定晚期效应 21。因此，照射后 $\sim 4-6$$\sim 4-6$∼4-6\sim 4-6 周是小鼠研究中“慢性”损伤的常用终点。
• 症状/测量指标：辐射性肠炎的小鼠模型通常监测体重和粪便排出量作为临床终点。胃肠道损伤在第一周内体重下降是预期现象，[77]指出照射小鼠通常在放疗后 $\sim 6$$\sim 6$∼6\sim 6 天体重迅速下降达到峰值，随后在 $\sim 30$$\sim 30$∼30\sim 30 天逐渐恢复（若存活）20。腹泻可通过计数成形粪便来量化（成形粪便数量减少表示腹泻）20。持续体重下降、高粪便排出量或粪便带血可作为持续肠炎的指标。其他症状（毛发蓬乱、活动减少）反映疾病状态，但特异性较低。对于慢性模型，还可监测存活率（若病情严重）或长期生长情况。
• 组织终点：处死时，对肠道进行组织学和分子学检查。小鼠慢性辐射性肠炎的关键特征包括隐窝丧失、黏膜萎缩、炎症和纤维化。因此，研究者通常测量组织切片中的隐窝密度和隐窝长度，计数杯状细胞，并评估炎症。例如，Grimaldi 等人在辐射后 38 天测量了结肠隐窝数量和长度 22。若存在纤维化，可通过三色染色进行评分。

• 慢性与急性区分：在小鼠结肠炎模型中，“急性”损伤对应于最初 1-2 周（腹泻，隐窝细胞凋亡），而“慢性”指的是持续的组织变化 $\ge 4-6$$\ge 4-6$>= 4-6\geq 4-6 周后。慢性肠炎的评估标准可能包括持续的隐窝丧失（与急性期的反弹性增殖相对）和持续的炎症浸润。总之，小鼠慢性放射性肠炎模型将追踪：（a）急性期（第 1-10 天）——体重/粪便变化及即时组织学；（b）晚期/慢性期（第 4-6 周）——长期体重恢复、组织学黏膜损伤及炎症和纤维化的分子标志物。具体时间线应在研究中明确（例如在第 4 周和第 8 周处死），如先前研究所示 $2120$$2120$21quad2021 \quad 20 。

第二部分：6-8 周龄 C57BL/6J 小鼠慢性放射性结肠炎模型设计

2.1 照射方案（剂量、分割、剂量率、设置）

2.2 局部照射与全腹照射（剂量梯度实验）

2.3 将临床放疗参数外推至小鼠模型

第三部分：照射后小鼠肠道组织采集

3.1 需采集的肠道段

3.2 组织采集的关键注意事项和最佳实践

• 快速且低温处理：安乐死小鼠后立即开腹，以减少自溶。将采集的肠道置于冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中冰镇保存。正如文献[65]所建议，一旦肠道被分离，应“迅速将其置于含有 10 mL 冰冷 PBS 的培养皿中”32。
• 细致解剖：首先识别关键解剖标志。一种方案建议先分离直肠并切除大肠 ${}^{30}$${}^{30}$^(30){ }^{30} 。然后定位胃部并在幽门处切断以释放十二指肠 ${}^{33}$${}^{33}$^(33){ }^{33} 。轻柔地剥离整个肠道：一手提起，另一手将肠道与肠系膜脂肪分离。尽量减少工具接触（例如使用手指代替镊子）以防止机械性撕裂 ${}^{34}$${}^{34}$^(34){ }^{34} 。
• 去除肠系膜脂肪：从浆膜表面剥离可见的脂肪组织。任何残留的脂肪都会干扰切片和染色，因此应仔细修剪 ${}^{34}$${}^{34}$^(34){ }^{34} 。
• 冲洗腔内容物：粪便会干扰组织学观察。为清洁腔道，使用装有冷 PBS 的注射器和灌胃针或喂食针。固定肠段的一端（例如十二指肠端或直肠端），通过冲洗将粪便冲出 ${}^{31}$${}^{31}$^(31){ }^{31} 。根据需要重复，直到腔道清晰。若内容物泄漏，需穿戴适当的个人防护装备（实验服、手套、护目镜）以防飞溅 ${}^{31}$${}^{31}$^(31){ }^{31} 。
• 分段并标记：如果不保存整个肠道，将清洗干净的肠道切成若干段（例如十二指肠、空肠、回肠、结肠）。保持方向的记录（近端与远端）——例如，用夹子标记“口侧”与“肛侧”，或在一侧做小墨点。方法说明[65]特别建议保存感兴趣的区域（如空肠），其余部分可丢弃，但在操作时应保持方向的记录 ${}^{35}$${}^{35}$^(35){ }^{35} 。
• 组织学的固定与取向：对于组织学分析，常用两种制备方法：瑞士卷法（将肠管绕在棒上成螺旋状，使一个横截面显示多个层面）
  连续环状）或将多个短段并排捆绑在胶带上 29。瑞士卷法允许检查一段长的连续切片，而捆绑法（如 Bialkowska 等人所述）则有助于对特定段进行定量分析。在任何情况下，都应将组织定向，使切割面垂直于腔道（以观察完整的隐窝-绒毛结构）。将组织段固定于 10%中性缓冲福尔马林中（通常室温过夜），然后转移至 $70\mathrm{\%}$$70\mathrm{\%}$70%70 \% 乙醇中，待石蜡包埋前使用 ${}^{36}$${}^{36}$^(36){ }^{36} 。该方案强调应尽快（在 $\sim 1$$\sim 1$∼1\sim 1 周内）进行包埋以保存形态 37。
• 避免损伤：整个过程中应轻柔操作，避免撕裂或拉伸肠道。[65] 警告说“过紧的卷曲可能压迫绒毛”，粗暴操作会破坏组织结构 $\begin{array}{cc}38& 39\end{array}$$\begin{array}{c}38\hspace{0.25em}\hspace{0.25em}\hspace{0.25em}\hspace{0.25em}39\end{array}$quad{:[38,39]:}\quad \begin{array}{ll}38 & 39\end{array} 。正确的操作可保持绒毛长度和黏膜表面。
• 分子检测的冷冻保存：如果采集组织用于 RNA 或蛋白质分析，应在冲洗后立即将组织块迅速冷冻于液氮中 ${}^{40}$${}^{40}$^(40){ }^{40} 。[68]指出结肠样本采用快速冷冻法用于 RT-PCR。将冷冻组织储存在 $-{80}^{\circ }\mathrm{C}$$-{80}^{\circ }\mathrm{C}$-80^(@)C-80^{\circ} \mathrm{C} 以备后续分析。

第四部分：小鼠模型中放射性肠炎的评估方法

4.1 可用的评估方法

• 临床体征和指标：定期监测体重和整体健康状况。放射损伤的小鼠通常在第一周体重下降（由于腹泻和摄入减少），若存活则可能恢复[19,20]。绘制体重百分比随时间变化的曲线是一种敏感的定量测量方法。粪便稠度可评分（正常、软便或腹泻）或通过计数一定时间内形成的粪球数量进行量化[20]。[77]指出腹泻（液体粪便）与体重减轻相关，存活者通常在 $\sim 30$$\sim 30$∼30\sim 30 天内恢复正常体重[20]。这些临床终点（体重和粪便排出量）为非侵入性指标，应在放射后前10天内频繁记录，因该阶段损伤达到高峰。
• 粪便生物标志物：非侵入性粪便检测可能具有实用价值。例如，粪便乳铁蛋白（肠道炎症的标志物）已被确定为辐射小鼠中的有用指标15。一项研究在实验过程中测量了粪便乳铁蛋白和弹性蛋白酶，发现其与结肠炎进展相关15。同样，也可以测量粪便隐血或钙卫蛋白。纵向监测这些标志物可以在不牺牲动物的情况下提供炎症的见解。
• 大体病理学：尸检时检查整个肠道。记录任何肉眼可见的发现（如扩张、水肿、出血、溃疡、粘连）。测量结肠长度（缩短是结肠炎的通用标志）并比较辐射组与对照组。拍摄代表性发现的照片。
• 组织学：这是肠道损伤的金标准。制备每个采样段的 H&E 染色切片。典型评估包括：
• 隐窝-绒毛结构：计算每单位黏膜长度内形成良好的隐窝数量，并测量隐窝的长度或深度 22。放射性肠炎通常导致隐窝丧失和缩短。每毫米隐窝数量减少和平均隐窝高度缩短均表明损伤。例如，Grimaldi 等人通过定量远端结肠切片中的“隐窝数量和长度”来评估损伤 22。
• 绒毛长度（小肠）：在小肠样本中，可以测量绒毛高度；绒毛变短反映损伤。
• 上皮连续性：检查是否存在溃疡或糜烂（上皮缺损），并对其范围进行分级。
• 细胞学变化：计算隐窝中凋亡细胞或有丝分裂象（急性放射导致隐窝细胞凋亡）。可通过 H&E 染色定量凋亡小体 41。
• 杯状细胞：使用 Alcian Blue（pH 2.5）或 PAS 染色鉴定杯状细胞。每个隐窝中杯状细胞数量的减少是黏膜损伤的标志 42。（Alcian Blue 染色和计数在 Grimaldi 的研究中进行 42。）
• 纤维化：使用 Masson 三色染色检测黏膜下层和肌层的胶原沉积，这是慢性损伤的特征。纤维化可定性评分（例如 0-3 级）或通过图像分析进行评分。
• 炎性浸润：注意固有层中炎性细胞（尤其是中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞）的存在及密度。慢性放射性肠炎通常伴有轻度淋巴-单核细胞浸润；急性损伤则出现中性粒细胞。

• 免疫组化（IHC）和免疫荧光：这些方法允许对细胞类型或特异性标志物进行评估。常见的 IHC 检测包括：
• Ki67 或 PCNA——增殖标志物。在再生或增生过程中，隐窝 Ki67 指数较高；在放射损伤中，隐窝增殖可能减少。Grimaldi 等人进行了 Ki67 染色并计数每个隐窝的细胞数 $\mathrm{Ki}{67}^{+}$$\mathrm{Ki}{67}^{+}$Ki67^(+)\mathrm{Ki} 67^{+} ${}^{23}$${}^{23}$^(23){ }^{23} 。较低的增殖指数表明干/祖细胞受损。
• 免疫细胞标志物：如巨噬细胞的 Iba1 或 F4/80，中性粒细胞的 Ly6G，T 细胞的 CD3。黏膜中巨噬细胞或中性粒细胞的增加表明存在炎症。[59]使用 Iba1 鉴定巨噬细胞 23。
• 紧密连接蛋白：通过免疫荧光检测 occludin、claudin 或 ZO-1 可揭示屏障破坏。放射性肠炎中已报道这些蛋白的丢失或错误定位。
• 肌成纤维细胞标志物： $\alpha$$\alpha$alpha\alpha -SMA 染色用于突出显示黏膜下层的肌成纤维细胞或活化的成纤维细胞，反映纤维化。
• 分子检测（基因/蛋白表达）：分析速冻组织中炎症或损伤相关基因的变化。RT-qPCR 可定量细胞因子（IL-6、TNF-α、IL-1β）、趋化因子（MCP-1）、氧化应激基因（iNOS）、凋亡调节因子（BAX/Bcl-2）、纤维化介质（TGF-β1）及紧密连接蛋白（ZO-1、闭合蛋白）的转录本。例如，在小鼠结肠炎模型中，Grimaldi 等通过 qPCR 测定 IL-6 和 TNF-α mRNA，发现辐射后其表达升高。同样，蛋白质印迹法可确认炎症蛋白的增加或连接蛋白的减少。
• 微生物组分析：可通过 16S rRNA 测序评估粪便和黏膜微生物群。菌群失调是放射性肠病的已知特征 ${}^{12}{}^{13}$${}^{12}{}^{13}$^(12)^(13){ }^{12}{ }^{13} 。可对粪便样本进行测序，绘制主要门或属的变化（如厚壁菌门/乳酸杆菌的减少，变形菌门的增多）。比较照射前后相对丰度的图示可直观展示这一变化。
• 通透性检测：进行 FITC-右旋糖酐灌胃或类似实验以检测“肠漏”。灌胃后血液中 FITC 水平升高表明肠道通透性增加，这是损伤的功能性后果。
• 生理学检测：虽然较少见，但可以通过测试营养物质吸收（如 D-木糖测试）或酶活性（如蔗糖酶）来评估功能性损伤。
• 流式细胞术：分离固有层淋巴细胞，并通过 FACS 定量免疫细胞亚群。这可以精确测量肠壁中 T 细胞（CD4、CD8）、B 细胞、巨噬细胞和中性粒细胞群体的变化。

4.2 手稿拟定图表内容（含参考文献）

• 图 1：实验方案时间线。示意图显示照射方案（如分次剂量和天数）及组织采集时间安排。例如，时间线条标示“第 0-4 天：盆腔放疗 10 Gy/天”，随后在第 3 天（急性期）和第 38 天（晚期）进行检测（如文献 14 所示）。该图可引用 Grimaldi 等人的方案（ $10\mathrm{Gy}\times 4$$10\mathrm{Gy}\times 4$10Gyxx410 \mathrm{~Gy} \times 4 ）14。
• 图 2：体重和临床评分。显示照射组与对照组小鼠体重（占基线百分比）随时间变化的折线图，和/或粪便形成的柱状图（例如每日平均粪球数）。此图仿照 Booth 等人及其他研究者的体重变化轨迹展示方式 20。参考点为
  照射小鼠在第6天体重下降 $\sim 10-20\mathrm{\%}$$\sim 10-20\mathrm{\%}$∼10-20%\sim 10-20 \% ，随后恢复（如文献[77]所述）。图中应包含误差线和 $p$$p$pp 值。
• 图 3：肠道代表性组织学（H&E 染色）。显示（A）对照组远端结肠，（B）急性时间点照射组结肠，（C）慢性时间点照射组结肠的 H&E 染色切片光微照片。箭头可标示隐窝脱落或绒毛钝化。附带定量分析：各组“每毫米黏膜隐窝数”和“平均隐窝长度”的柱状图 22。此方法遵循 Grimaldi 对隐窝形态计量分析的展示 22。
• 图 4：杯状细胞分析。对照组与照射组小鼠结肠切片的 Alcian Blue 染色图像，显示分泌粘液的杯状细胞。对应的柱状图显示每个隐窝中杯状细胞的平均数量 42。（在文献[59]中，杯状细胞计数采用 Alcian Blue 测定。）杯状细胞减少表明黏膜损伤。
• 图 5：增殖与炎症的免疫组化分析。面板显示(A)对照组与照射组小鼠结肠隐窝中的 Ki67 染色，(B)结肠组织中 Iba1（巨噬细胞标志物）染色。包括每个隐窝中 $\mathrm{Ki}{67}^{+}$$\mathrm{Ki}{67}^{+}$Ki67^(+)\mathrm{Ki} 67^{+} 细胞的定量及 ${\mathrm{Iba}}^{+}$${\mathrm{Iba}}^{+}$Iba^(+)\mathrm{Iba}^{+} 细胞（或面积） ${}^{23}$${}^{23}$^(23){ }^{23} 的数量。这突出显示了辐射后增殖反应的降低和免疫细胞浸润的增加。
• 图 6：炎症的分子标志物。结肠样本中炎症细胞因子（如 IL-6、TNF-α）及应激标志物的 RT-qPCR 或 ELISA 数据柱状图。例如，图表可显示照射组与对照组结肠中 IL-6 mRNA 的倍数变化（对应 Grimaldi 研究中 IL-6 的分析 ${}^{40}$${}^{40}$^(40){ }^{40} ）。包含多个基因（Il1b、iNOS、Bax 等）作为独立柱状条，有助于展示损伤的分子特征。
• 图 7：粪便生物标志物。粪便乳铁蛋白水平（通过 ELISA 测量）在多个时间点（例如放射治疗前、10 天、25 天、38 天）的折线图或柱状图。此图基于 Grimaldi 使用乳铁蛋白作为无创标志物的模型 ${}^{15}$${}^{15}$^(15){ }^{15} 。放射治疗后粪便乳铁蛋白的显著升高将支持结肠持续炎症的存在。
• 图8：肠道微生物群组成。放射治疗前后粪便样本中主要细菌门类（厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门等）的堆积柱状图。此图遵循放射线引起菌群失调的范式12 13。例如，可能显示放疗后变形菌门的增加。关于这一概念的参考文献为综述，指出微生物组在放射性肠炎中的作用12。